Séquençage métagénomique viral

En tant que fournisseur expérimenté de services NGS et partenaire d'Illumina, CD Genomics s'engage à offrir des quantités sans précédent de données de séquence permettant des approches analytiques rapides et innovantes avec des solutions rentables. Nous avons une solide expertise dans la fourniture d'un service de séquençage métagénomique viral confiant et impartial en utilisant des séquenceurs à haut débit de pointe, des stratégies de séquençage, et bioinformatique pipelines.

Introduction à la séquençage métagénomique viral

Les virus sont les entités biologiques les plus abondantes au monde, dépassant le nombre de cellules microbiennes dans la plupart des environnements dans un rapport de 10:1. Les virus habitent constamment notre corps, et les hôtes asymptomatiques ne font pas exception. Cette vision émergente souligne la nécessité d'explorer le virome. La métagénomique virale peut fournir des informations sur la composition et la structure des communautés virales. Le profilage de la composition taxonomique des communautés virales est important non seulement pour la recherche fondamentale, mais aussi pour la science et la pratique cliniques.

Cependant, les communautés virales sont difficiles à caractériser car il n'existe pas de gène unique partagé par tous les génomes viraux, ce qui limite l'application des méthodes analogues utilisées chez les bactéries pour le profilage de l'ADN ribosomal. La faible abondance de l'ADN libre et cellulaire constitue un autre défi. Séquençage shotgun métagénomique et RNA-seq Il existe deux approches pour la caractérisation des communautés virales. Le séquençage direct peut entraîner un fort bruit de fond de matériel génétique. Par conséquent, des procédures supplémentaires sont nécessaires pour concentrer et purifier les particules virales (PV). Plusieurs méthodes d'enrichissement viables ont été suggérées, y compris la filtration, l'ultracentrifugation, le traitement par nucléases, l'amplification par déplacement multiple (MDA), la bibliothèque de tir aléatoire amplifiée par linker (LASL) et l'approche PCR aléatoire.

Avantages du séquençage métagénomique viral

• Pas besoin de cultures ou de tests de laboratoire d'anticorps.
• Informations complètes sur la biodiversité communautaire, la taxonomie et la fonction.
• Les applications prometteuses incluent la découverte de virus et l'identification de pathogènes viraux associés à l'horticulture, à la médecine vétérinaire et à la santé humaine, en particulier pour les cas difficiles à diagnostiquer.

Application du séquençage métagénomique viral

(1) Traitement des maladies : L'étude de la diversité virale, la découverte de virus inconnus, l'analyse de détection de virus/bactériophages spécifiques et l'interaction entre les bactéries et les bactériophages (dans des aspects tels que l'intestin, la peau, l'environnement, etc. et en relation avec la santé) sont des éléments essentiels à aborder. L'investigation des relations entre les virus et les maladies (telles que les maladies métaboliques, les maladies gastro-intestinales, les maladies respiratoires, les allergies, les maladies infectieuses, les maladies buccales et les tumeurs) peut considérablement enrichir notre compréhension. Des techniques comme la thérapie par bactériophages et la sensibilisation des bactéries résistantes aux antibiotiques pourraient potentiellement stimuler les réponses immunitaires.

(2) Sécurité alimentaire : La surveillance des virus dans les aliments, la compréhension de la diversité virale d'origine alimentaire, l'investigation des agents pathogènes transmis par les aliments et la surveillance des virus pendant le traitement des aliments sont des mesures clés. La traçabilité des incidents de contamination virale et l'étude du lien entre les virus et le microbiome alimentaire peuvent contribuer de manière significative à garantir la sécurité alimentaire.

(3) Industrie de l'élevage : La gestion des maladies dans l'élevage, comme le traitement de la diarrhée, de la fièvre porcine, de la fièvre aphteuse, des maladies zoonotiques et l'analyse des excréments d'animaux sauvages, est essentielle pour maintenir la santé du bétail.

(4) Surveillance des maladies infectieuses : La surveillance des virus environnementaux peut fournir des indices de détection précoce et de surveillance pour les épidémies de maladies, contribuant ainsi de manière significative aux initiatives de santé publique.

(5) Génie environnemental : Dans les domaines du génie environnemental tels que le traitement des eaux usées et le contrôle de la pollution, comprendre les communautés virales dans les masses d'eau aide à évaluer l'efficacité des traitements et l'impact environnemental. Cela s'applique à divers environnements tels que les systèmes de transport public, les hôpitaux, les océans, les masses d'eau douce, l'air et les glaciers.

(6) Découverte de médicaments : La recherche sur le virome peut révéler des virus susceptibles d'interagir avec les hôtes, fournissant des indices pour la découverte de nouveaux médicaments.

(7) Agriculture : L'étude de la diversité virale des plantes et des sols pourrait soutenir le développement de biopesticides dans le secteur agricole.

Flux de travail de séquençage métagénomique viral

Notre équipe d'experts hautement expérimentés met en œuvre la gestion de la qualité en suivant chaque procédure pour garantir des résultats complets et précis. Le flux de travail général pour le séquençage métagénomique viral par shotgun est décrit ci-dessous. En résumé, les étapes de base impliquées dans la métagénomique virale comprennent l'isolement et la purification des particules virales par filtration en taille ou centrifugation basée sur la densité, l'amplification indépendante de la séquence de l'acide nucléique viral, le séquençage shotgun ou RNA-seq et des analyses appariées sur la diversité, la taxonomie et la fonction à l'aide d'une batterie d'outils bioinformatiques fiables.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Sources d'échantillons incluant des échantillons environnementaux et cliniques. Contrôle de qualification d'échantillon Isolement et purification des VPs et amplification indépendante de la séquence
	Plateformes de séquençage Plateformes HiSeq, paire de lectures de 150 pb, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400 Plus de 2 Go de données brutes par échantillon Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30 SMRT de PacBio La technologie est également disponible pour le séquençage de longs fragments, ce qui fournit des séquences plus précises et contiguës.
	Analyse bioinformatiqueNous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : L'élimination de la contamination liée à l'hôte et aux bactéries. Alignement de nucléotides (VirFinder, VirusFinder et BLAST) Alignement de protéines (RefSeq) De nouveau assemblage, identification taxonomique, graphique de couverture, et analyse phylogénétique …et plus encore

Pipeline d'analyse

Livrables

• Contrôle de qualité et suppression d'hôte
• Analyse des espèces de lectures
• Assemblée
• Analyse des espèces assemblées
• Analyse fonctionnelle
• Prédiction des hôtes de phages

En plus du séquençage métagénomique viral qualifié, nous offrons une assistance, y compris la conception expérimentale, la détermination de la plateforme de séquençage appropriée, des outils logiciels et des méthodologies d'analyse, pour répondre à votre projet. Si vous avez des exigences ou des questions supplémentaires, n'hésitez pas à nous contacter, nos spécialistes expérimentés se feront un plaisir de vous aider à résoudre vos interrogations.

Références :

1. Li Y, et al. VIP : un pipeline intégré pour la métagénomique de l'identification et de la découverte de virus. Rapports scientifiques, 2016, 6 : 3774
2. Rampelli, S. et al. ViromeScan : un nouvel outil pour le profilage des communautés virales métagénomiques. BMC Genomics. 2016, (17):165.
3. Lewandowska D W, Zagordi O, Geissberger F D, et al. Optimisation et validation de la préparation des échantillons pour le séquençage métagénomique des virus dans des échantillons cliniques. Microbiome, 2017, 5(1) : 94.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Par contenu de séquence de base.

Contenu en GC par séquence.

Abondance_fusionnée.

Carte de chaleur d'abondance au niveau familial.

Classification KEGG.

Classification des fonctions CAZy.

Analyse des boxplots basée sur Bray-Curtis (A), Jaccard binaire (B), Unifrac non pondéré (C) et Unifrac pondéré (D).

Analyse PCoA basée sur Bray-Curtis (A), Jaccard binaire (B), Unifrac non pondéré (C) et Unifrac pondéré (D).

Arbre de regroupement UPGMA.

1. Quelles sont les approches pour le séquençage du génome entier des pathogènes ?

Il existe actuellement trois approches principales pour séquençage du génome entier des agents pathogènes, c'est-à-dire, séquençage métagénomiqueséquençage d'amplicons PCR et séquençage par enrichissement ciblé (Figure 1). Le séquençage métagénomique direct fournit une représentation précise et intégrée des séquences au sein d'un échantillon. Le séquençage d'amplicons PCR effectue des réactions PCR pour enrichir le génome viral, ce qui augmente considérablement la charge de travail pour les grands génomes mais réduit les coûts. Le séquençage par enrichissement ciblé utilise des sondes nucléotidiques spécifiques aux virus liées à une phase solide pour enrichir le génome viral dans une seule réaction, ce qui réduit la charge de travail mais augmente le coût par rapport au séquençage d'amplicons PCR. Les avantages et les inconvénients sont listés dans le Tableau 1. Il montre que le séquençage métagénomique viral présente des avantages uniques pour étudier les pathogènes et caractériser la diversité virale dans des échantillons environnementaux et cliniques.

Figure 1. Les principales approches utilisées pour le séquençage du génome viral (Houldcroft et al. 2016).

Tableau 1. Avantages et inconvénients des différentes méthodes de séquençage des génomes viraux (Houldcroft et al. 2016).

2. Quel est le pipeline bioinformatique général pour le séquençage métagénomique viral ?

Après le séquençage, les lectures NGS brutes sont d'abord prétraitées par la suppression des adaptateurs, des séquences de faible qualité et de faible complexité, suivie d'une soustraction computationnelle des lectures liées à l'hôte. Dans un mode rapide, les virus sont identifiés par alignement avec la base de données de nucléotides ViPR/IRD. Dans un mode plus sensé, les lectures de bactéries et d'ARN ribosomal apparentés sont supprimées avant l'alignement avec la base de données des virus. Les lectures non appariées sont ensuite alignées avec une base de données de protéines virales (base de données NCBI RefSeq). Ensuite, l'identification taxonomique (Taxl), le graphique de couverture (Covplot), de novo l'assemblage (k-mer multiples) et l'analyse phylogénétique (PhyGo) peuvent être effectués.

Références :

1. Houldcroft C J, Beale M A, Breuer J. Perspectives cliniques et biologiques issues du séquençage du génome viral. Nature Reviews Microbiology, 2017, 15(3) : 183-192.
2. Li Y, Wang H, Nie K, et al. VIP : un pipeline intégré pour la métagénomique de l'identification et de la découverte de virus. Scientific reports, 2016, 6.

Détection et séquençage du virus Zika à partir du liquide amniotique de fœtus présentant une microcéphalie au Brésil : une étude de cas

Journal : The Lancet Infectious Diseases

Facteur d'impact : 19,864

Publié : 17 février 2016

Arrière-plans

Les cas de microcéphalie au Brésil en 2015 étaient 20 fois plus nombreux que les années précédentes. Les données épidémiologiques suggèrent que l'incidence de la microcéphalie au Brésil pourrait être associée au virus Zika. Les auteurs ont prélevé des échantillons de liquide amniotique chez deux femmes enceintes au Brésil dont les fœtus ont été diagnostiqués avec une microcéphalie, dans le but d'enquêter sur la cause de la microcéphalie.

Méthodes

Résultats

Assemblage du génome du virus Zika

Après avoir éliminé la contamination cellulaire, 288 904 séquences avaient une similarité avec des génomes viraux, et 683 séquences correspondaient au génome du virus Zika. La figure 1 montre le génome complet du virus Zika isolé du patient 1 avec annotation des gènes.

Figure 1. Diagramme de l'Atlas génomique comparatif BLAST du virus Zika. Le cercle vert correspond au virus Zika brésilien complet isolé du patient 1. Le cercle rouge correspond à la souche du virus Zika du Sénégal. Le cercle bleu correspond à la souche de l'Ouganda.

2. Analyse phylogénétique

Les analyses phylogénétiques ont été réalisées avec la région codante pour les gènes de l'enveloppe (Figure 2) et NS5 (Figure 3), respectivement. La région géographique de la souche du virus Zika brésilien n'a pas pu être déduite en raison de limitations d'échantillonnage, mais elle semblait plus étroitement liée à celle de la Polynésie française qu'aux souches africaines.

Les distributions géographiques et chronologiques des lignées du virus Zika indiquent que la souche d'Asie du Sud-Est pourrait s'être génétiquement isolée des souches africaines pendant environ 50 ans. Ce schéma a été confirmé par la distance génétique entre les nouvelles séquences du virus Zika brésilien et le génome du virus Zika ougandais (Figure 4).

Figure 2. Topologies de vraisemblance maximale de la région génomique de l'enveloppe du virus Zika brésilien.

Figure 3. Topologies de vraisemblance maximale de la région génomique NS5 du virus Zika brésilien.

Figure 4. Phylogénie par maximum de vraisemblance du virus Zika brésilien, d'autres génomes de Flaviviridae et d'un génome d'alphavirus. DENV=virus de la dengue, JEV=virus de l'encéphalite japonaise. YFV=virus de la fièvre jaune. ZIKA=virus Zika.

L'infection par le virus Zika pourrait se produire par transmission transplacentaire.

Cet article a été le premier à isoler l'ensemble du génome du virus Zika à partir du liquide amniotique, ce qui a suggéré que l'infection par le virus Zika pourrait se produire par transmission transplacentaire.

Référence :

1. Calvet G, Aguiar R S, Melo A S O, et al. Détection et séquençage du virus Zika à partir du liquide amniotique de fœtus présentant une microcéphalie au Brésil : une étude de cas. The Lancet des maladies infectieuses, 2016, 16(6) : 653-660.