Séquençage RNA dual

Le séquençage RNA double a montré qu'il permet de surveiller toutes les classes de transcrits codants et non codants à la fois chez l'hôte et le pathogène. CD Genomics propose un service de séquençage RNA double haute résolution, abordable et simple pour fournir un aperçu direct de l'interaction hôte-pathogène.

Qu'est-ce que le séquençage d'ARN dual ?

Il existe une large gamme d'interactions entre les espèces, telles que le parasitisme, la symbiose, la compétition, etc. Le séquençage transcriptomique conventionnel ne peut étudier que les informations d'une seule espèce, ce qui non seulement gaspille une partie des données, mais affecte également l'échantillon lui-même lors de la séparation de deux espèces.

La technologie de séquençage Dual RNA-seq a été développée précisément pour répondre à ce type de questions. En construisant une seule bibliothèque de transcriptome, le dual RNA-seq d'ARN total mélangé après une déplétion double d'ARNr ou une capture de poly(A) permet de séquencer et d'analyser deux (ou plusieurs) espèces en même temps sans avoir besoin de séparer les espèces, révélant ainsi les changements dynamiques dans l'expression des gènes entre elles. Parallèlement, à travers le diagramme du modèle d'interaction, il est possible d'obtenir la relation régulatrice des gènes et le mécanisme d'interaction entre deux espèces ; d'étudier le réseau régulateur dans le processus d'interaction, le mécanisme d'infection par le pathogène et la résistance de l'hôte à la maladie ; et d'explorer la relation évolutive des pathogènes parmi différentes espèces, et d'explorer davantage la sélection positive des gènes connexes sur la base des gènes homologues.

CD Genomics peut traiter divers modèles d'invasion - pathogènes impliquant des bactéries, des champignons, des protozoaires, etc. L'hôte peut être un mammifère ou une plante. Nous visons à fournir des services complets de séquençage d'ARN double, de la conception expérimentale à l'analyse biocomputationnelle, pour soutenir vos besoins de recherche.

Avantages de notre service de séquençage RNA double

• Disponible pour divers modèles d'invasion
• Flexibilité du type d'échantillon : ARN mixte total, cellules hôtes infectées, etc.
• La technologie des codes-barres moléculaires permet d'utiliser de petites quantités de modèle d'entrée.
• Analyse complète, haute stabilité : Utilisation du séquençage sur plateforme Illumina avancée, combinée à l'informatique haute performance (HPC), pour obtenir une analyse et une livraison rapides et stables des données de séquençage.
• Contrôle qualité strict, pipelines d'analyse diversifiés : Mise en œuvre de mesures de contrôle qualité rigoureuses et offre de pipelines d'analyse diversifiés. Non seulement fournir une analyse du transcriptome pour les espèces, mais également configurer des analyses avancées telles que l'analyse de réseau de co-expression génique pondérée (WGCNA), l'annotation des facteurs de virulence, l'analyse des réseaux d'interaction protéine-protéine, etc., pour explorer en profondeur les informations sur les relations inter-espèces.
• Conception scientifique et méticuleuse : De la sélection des échantillons, la préparation des bibliothèques, le séquençage, à l'analyse des données, chaque étape fait l'objet d'une conception scientifique et méticuleuse pour garantir des résultats de recherche de haute qualité.

Applications du séquençage RNA double

• Maladies des plantes et mécanismes de résistance-susceptibilité.
• Adaptation physiologique et réponses moléculaires.
• Pathogènes et immunité de l'hôte.
• Symbiose interespèces et mécanismes évolutifs.
• Parasitisme dans la défense des ravageurs et des hôtes.
• Co-cultivation de bactéries/fongis.
• Recherche sur les maladies infectieuses.
• Génomique comparative et mécanismes pathogènes.

Flux de travail du séquençage d'ARN double (Dual RNA-seq)

Lors de la préparation de votre échantillon, CD Genomics propose une gamme complète de services de séquençage et d'analyses bioinformatiques.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon : ARN total ≥ 1 μg, Concentration ≥ 10 ng/µL, OD260/280 = 1,8-2,0 Cellules ≥ 5×106 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 100 mg
	Séquençage Plateforme Illumina Séquençage PE150 12-24 Go
	Analyse des données Analyse du transcriptome Analyse de Réseau de Co-expression Génétique Pondérée (WGCNA) Annotation des facteurs de virulence Analyse du réseau d'interaction protéine-protéine …et plus

Pipeline d'analyse

Pipeline générique d'analyse des données de séquençage RNA double (figure de V. Arluison et al., 2018)

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le Dual RNA-seq pour votre rédaction (personnalisation)

Le séquençage RNA dual (Dual RNA-seq) est une technique de séquençage à la pointe de la technologie développée pour relever de tels défis. Spécialisé dans l'étude des interactions hôte-pathogène, CD Genomics utilise une analyse avancée des données de séquençage RNA dual pour propulser les avancées scientifiques dans ce domaine. Nos solutions personnalisées, notre expertise en bioinformatique et notre engagement indéfectible envers la qualité garantissent aux chercheurs d'obtenir des informations précises, fiables et significatives sur le monde complexe des interactions hôte-pathogène. Pour plus d'informations sur nos services, nous vous invitons à nous contacter.

Références :

1. Alexander J. Westermann, et al., Le séquençage d'ARN double révèle les fonctions des ARN non codants dans les interactions hôte-pathogène. Nature. 2016, vol. 000.
2. Alexander J. Westermann, et al., Résolution des interactions hôte-pathogène par séquençage d'ARN double. PLoS Pathog2017, 13(2).
3. Véronique Arluison et Claudio Valverde (éds.), ARN régulateurs bactériens : Méthodes et protocoles. Méthodes en biologie moléculaire2018, vol. 1737.
4. Pisu et al., Le séquençage d'ARN double des macrophages infectés par Mtb in vivo révèle des interactions hôte-pathogène ontologiquement distinctes. Cell Reports2020, vol. 30.
5. Nuss A M, Beckstette M, Pimenova M, et al. Le séquençage d'ARN double tissulaire permet une découverte rapide des fonctions spécifiques à l'infection et des riborégulateurs façonnant les transcriptomes hôte-pathogène. Actes de l'Académie nationale des sciences, 2017, 114(5) : E791-E800.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Des génomes de référence sont-ils nécessaires pour toutes les espèces subissant un séquençage d'ARN double ?

Idéalement, la disponibilité de génomes de référence pour les deux espèces interagissantes faciliterait des résultats plus précis. Cependant, la littérature documente également des procédures où seule une espèce dispose d'un génome de référence. Le flux de travail d'analyse dans de tels cas consiste d'abord à mapper les données de séquençage sur l'espèce ayant un génome de référence. Les données transcriptomiques, après exclusion des données de mappage, peuvent être analysées pour obtenir des informations sur l'autre espèce par le biais d'un mappage avec un proche parent ou d'un assemblage de novo, facilitant les analyses ultérieures. En particulier, pour le segment procaryote dans un échantillon interagissant, la présence d'un génome de référence est impérative. Cependant, en son absence, le profilage du 'pan-génome' bactérien peut être mis en œuvre.

2. Quels sont les avantages des transcriptomes interactifs par rapport aux transcriptomes ordinaires ?

Le séquençage RNA double est une technique de séquençage spécialisée conçue pour explorer les interactions interspécifiques, englobant généralement des relations symbiotiques, parasitaires, compétitives et prédatrices. Traditionnellement transcriptomique nécessite la séparation de ces espèces interactives, une approche qui, bien que utile, peut entraîner une perte d'informations pertinentes et introduire des artefacts potentiels liés au processus de ségrégation. En revanche, l'approche dual RNA-seq permet des investigations simultanées de deux espèces interactives ou de plusieurs espèces sans nécessiter leur partitionnement. Par conséquent, cela contourne l'influence néfaste possible due à la séparation des espèces. De plus, cette méthodologie est économique, nécessitant la construction d'une seule bibliothèque de transcriptomes, ce qui permet l'analyse concurrente de toutes les espèces incluses.

3. Quels sont les différents types de RNA-seq ?

De plus, en fonction des objectifs de recherche et des particularités de l'échantillon, le RNA-seq peut être subdivisé en plusieurs types tels que : RNA-seq total, séquençage d'ARNm, séquençage de miARN, Séquençage de l'ARN non codant long, Séquençage du transcriptome complet, Séquençage d'ARN circulaireet entier Exome RNA-seq.

Le séquençage d'ARN dual révèle la dépendance métabolique en acides aminés de la bactérie intracellulaire Piscirickettsia salmonis infectant le saumon atlantique.

Journal : Frontiers en microbiologie
Facteur d'impact : 6,064
Publié : 27 novembre 2018

Résumé

Séquençage à haut débit technologies, appliquées à la recherche transcriptomiqueRNA-Seq), ont ouvert la possibilité de comprendre des réactions moléculaires complexes dans différents contextes biologiques. Récemment, le séquençage synchronisé des transcriptomes d'un pathogène et de son hôte pendant l'infection - connu sous le nom de dual RNA-seq - a émergé comme une méthode prometteuse pour dévoiler les complexités des interactions hôte-pathogène. Dans cette étude particulière, grâce à l'épuisement du rRNA dual et au schéma de séquençage de l'ARN, les chercheurs ont analysé simultanément les transcriptomes de la bactérie intracellulaire. Piscirickettsia chez le saumon et ses espèces hôtes, Saumon atlantique, tout au long de l'infection.

Méthodes

Résultats

Exploration du transcriptome de l'hôte et du pathogène pendant la pathogénèse

L'analyse de séquençage d'ARN double a délimité la régulation des transcriptomes de P. salmonis et de S. salar au cours de l'infection. En ce qui concerne le transcriptome de S. salar, 771 et 829 gènes étaient exprimés différemment dans la rate à 7 et 14 jours post-infection respectivement (Fig 1B). Parallèlement, 412 et 467 gènes étaient régulés différemment à ces mêmes moments dans le rein céphalique. Les gènes spécifiquement modulés dans le rein céphalique comprenaient ceux codant pour des protéines de la famille des MATE, la protéine de réparation de l'ADN RecN, la protéine chaperonne HtpG et diverses protéines de membrane (Fig 2). Parmi les gènes partagés, différents phosphatases protéiques 1, protéines ribosomiques, chaperonnes moléculaires et sous-unités du transamidosome Asn/Gln ont été identifiés (Fig 2).

FIGURE 1. (A) Analyse transcriptomique globale de Piscirickettsia salmonis (bleu) et S. salar (rouge) à 3, 7 et 14 jours post-infection (dpi) dans les tissus de la rate et du rein céphalique. Les valeurs d'expression ont été estimées en tant que transcrits par million de lectures (TPM) et transformées en Log2 pour le regroupement sur carte thermique. (B) Gènes différentiellement exprimés dans la rate et le rein céphalique à 7 et 14 dpi en utilisant comme contrôle les valeurs d'expression à 3 dpi. Trois jours post-infection ont été utilisés comme expression génique de référence puisque aucune lecture bactérienne ne serait présente dans aucun type de groupe de contrôle.

FIGURE 2. Diagramme de Venn montrant le nombre de gènes exclusifs et partagés dans le transcriptome de P. salmonis durant l'infection dans la rate (bleue) et les tissus du rein céphalique (rouge) du saumon atlantique. Les cartes thermiques montrent un sous-ensemble de gènes exclusifs et partagés exprimés par P. salmonis dans les deux tissus.

Métabolisme des acides aminés : une réponse commune entre P. salmonis et S. salar

L'analyse d'enrichissement GO a indiqué qu'une grande proportion des gènes exprimés de manière différentielle dans P. salmonis étaient associés aux processus métaboliques des protéines et des composés azotés. Un enrichissement des gènes liés au métabolisme des protéines a également été découvert grâce à l'annotation KEGG. Cependant, bien que le métabolisme des acides aminés ne soit pas la principale réponse transcriptomique au sein de l'hôte, les deux P. salmonis et S. salar a démontré de nombreux gènes liés à la synthèse biologique et à la dégradation des acides aminés.

FIGURE 3. Annotation de l'ontologie génique (A) et annotation du chemin KEGG (B) des gènes exprimés de manière différentielle dans Saumon atlantique et P. salmonis pendant l'infection.

Conclusion

Au-delà des réponses immunitaires standard de l'hôte et des facteurs de virulence des pathogènes, à la fois les bactéries et l'hôte présentent une profusion de gènes associés aux processus métaboliques, en particulier ceux liés au métabolisme des acides aminés. Nos résultats indiquent une dépendance de P. salmonis sur le métabolisme des acides aminés de S. salar, ce qui pourrait suggérer un nouveau mécanisme de pathogénie basé sur la capacité à absorber des nutriments de l'hôte. En termes généraux, le séquençage du transcriptome dual permet une perspective variée sur l'interaction entre l'hôte et le pathogène, transcendant les processus biologiques liés à l'immunité.

Référence :

1. Valenzuela-Miranda D, Gallardo-Escárate C. Le séquençage RNA dual révèle la dépendance métabolique des acides aminés de la bactérie intracellulaire Piscirickettsia salmonis infectant le saumon atlantique. Frontières en microbiologie, 2018, 9 : 418416.