Séquençage de dégradome

CD Genomics est désormais en mesure de fournir un service de séquençage du dégradome pour faciliter une compréhension plus complète du paysage des microARN chez les plantes. En utilisant notre service, vous pouvez détecter les cibles d'ARNm des microARN de manière très sensible et précise.

L'introduction du séquençage Degradome

Les microARN (miARN) sont une classe d'ARN non codants endogènes de 20 à 24 nucléotides (nt) de longueur, produits par une excision très précise à partir de précurseurs en boucle tige. Les microARN sont des régulateurs importants de l'expression génique aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. Le miARN mature est recruté dans un complexe de silençage induit par l'ARN (RISC) pour dégrader les cibles d'ARNm et supprimer leur traduction. Les miARN sont fortement conservés parmi les espèces sur la base de comparaisons entre différentes espèces. Il existe également des miARN non conservés et spécifiques à certaines espèces chez les plantes. Les miARN non conservés sont souvent exprimés à de faibles niveaux et, par conséquent, beaucoup ne sont pas identifiés dans les projets de séquençage à petite échelle. Séquençage des petits ARN La technologie a permis l'identification de miARNs à faible abondance.

La méthode RACE 5' modifiée (amplification rapide des extrémités de l'ADNc) a été largement utilisée pour la confirmation des cibles et le cartographie des sites de clivage. Néanmoins, cette approche est laborieuse, chronophage, coûteuse et n'est applicable qu'à des investigations de grande précision. Récemment, le séquençage du dégradome, également appelé analyse parallèle des extrémités d'ARN (PARE), a émergé comme une méthode puissante qui combine les deux. séquençage à haut débit et a modifié le 5' RACE pour dépister les miARN et les ta-siARNtransmettre-acting siRNA) cibles à grande échelle. Dans cette méthode, l'ARNm capé dégradé est lié à un adaptateur et transcrit inversement. Les fragments sont ensuite digérés par Mmel, purifiés, liés à un adaptateur 3'- et amplifiés par PCR. Le séquençage profond du cDNA et l'analyse du dégradome fournissent des informations complètes sur les transcrits non capés qui subissent une dégradation dans les plantes.

Avantages du séquençage dégradome

• Identification des miARN connus et nouveaux et des ta-siARN
• Identification des cibles de miARN et des réseaux régulateurs
• Résumé statistique des sites de dégradation de l'ARNm
• Explore de nouveaux biomarqueurs et réseaux de régulation des circARN.
• Haute capacité et haute résolution

Flux de travail de séquençage Degradome

Le flux de travail général pour le séquençage du degradome est décrit ci-dessous. Pour construire une bibliothèque de séquençage du degradome, la première étape consiste à ligaturer des échantillons d'ARN polyA à un adaptateur d'ARN contenant un site 3'Mme I, puis à les transcrire. Après la synthèse de la seconde chaîne, la digestion par Mme I, la purification par gel et l'amplification par PCR, un adaptateur 3' est ligaturé pour le séquençage approfondi. Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Type d'échantillon : ARN total sans dégradation ni contamination par l'ADN ARN total ≥ 20 μg, Quantité minimale : 15 μg, Concentration ≥ 100 ng/µL OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Préparation de la bibliothèque Degradome Illumina HiSeq SE50 Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données brutes Cartographie basée sur des références Identification des ARN non codants connus et nouveaux Analyse de la distribution des fragments de dégradation dans la région sélectionnée du génome Identification des ARNm cibles Résumé statistique du site de dégradation de l'ARNm Analyse GO/KEGG Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage Degradome pour votre rédaction (personnalisation)

Soutenu par nos scientifiques expérimentés et notre technologie avancée, CD Genomics peut vous aider à identifier des cibles de petits ARN avec une résolution à base unique en une seule fois grâce à le séquençage à haut débit par un contrôle qualité strict et des analyses bioinformatiques avancées. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

FAQs sur Degradome Seq

1. Quel est le principe du séquençage du degradome ?

Chez les animaux, il est supposé que la répression des protéines se produit par inhibition de la traduction accompagnée de dégradation de l'ARNm. Chez les plantes, les miARN dégradent leurs cibles d'ARNm par clivage précis entre le 10e et le 11e nucléotide à partir de l'extrémité 5' du miARN dans la région complémentaire du transcrit cible, générant un pic distinct de séquence de dégradome au site de clivage prédit par rapport à d'autres régions du transcrit. Basé sur ce principe, le séquençage du dégradome est principalement utilisé pour identifier globalement les restes de clivage dirigé par les petits ARN en séquençant les extrémités 5' des ARN non coiffés chez les plantes.

2. Quels sont les avantages du séquençage du dégradome pour l'identification des cibles des miARN ?

Tableau 1. La comparaison du séquençage du degradome et des méthodes traditionnelles pour la prédiction des cibles de miARN.

3. En quoi le séquençage du dégradome est-il différent des autres méthodes de séquençage de l'ARN ?

Le séquençage de dégradome se concentre spécifiquement sur les produits de dégradation de l'ARN, tandis que d'autres méthodes de séquençage de l'ARN comme RNA-Seq analyser généralement l'ensemble du transcriptome. Cela rend le séquençage du degradome particulièrement adapté à l'étude des événements de clivage de l'ARN médiés par les miARN/siARN.

Référence

1. Riffo-Campos, Á.L., et al.Outils pour la prédiction des cibles de miARN basés sur la séquence : que choisir ? Journal international des sciences moléculaires, 2016, 17(12) : 1987.

Études de cas Degradome Seq

Le séquençage des petits ARN et du dégradome révèle une fonction importante des microARN dans Astragale chrysochlorus réponse aux stimuli du sélénium

Journal : Journal de biotechnologie végétale
Facteur d'impact : 6,305
Publié : 21 mai 2015

Résumé

Astragale les espèces connues comme hyperaccumulateurs de Se en le convertissant en composés non aminés. Mais nous n'avons aucune idée de l'hyperaccumulation liée au métabolisme du Se. Les auteurs ont tenté de comprendre si les miARN jouent un rôle dans l'accumulation de Se chez les plantes. Dans cette étude, ils ont identifié 418 miARN connus et 151 miARN nouveaux induits par l'exposition au Se dans Astragale chrysochlorus. Grâce au séquençage approfondi du dégradome, les auteurs ont révélé une fonction importante des miARN dans A. chrysochlorus réponse aux stimuli du sélénium.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Identification et profils d'expression des miARN.

Un total de 418 miARN connus et 151 miARN novateurs a été identifié. La distribution des miARN entre le contrôle et le traitement au Se est illustrée dans la figure 1. Les 418 miARN appartiennent à 380 familles de miARN, et 160 familles de miARN étaient exprimées différemment dans les échantillons de contrôle et traités au Se. 30 miARN novateurs étaient exprimés différemment après le traitement au Se.

Figure 1. Distribution des miARN entre le contrôle et le traitement au Se : (a) miARN conservés ; (b) nouveaux miARN.

Figure 2. Profils d'expression des petits ARN du cal de contrôle et traité au Se de Un. chrysochlorus.

Figure 3. Profils d'expression de miARN sélectionnés au hasard avec des abondances différentes dans le traitement au Se. Un. chrysochlorus calli. Un total de 1339 sites prédits ont été identifiés et déterminés comme étant clivés par 499 miARN. Les gènes cibles ont été annotés et classés en tant que facteurs de transcription et leurs sous-unités, gènes codant des enzymes, protéines de résistance, répétitions riches en leucine, fermetures en leucine, protéines à doigt de zinc, et d'autres protéines structurelles et fonctionnelles.

Figure 4. Graphiques cibles (t-plots) des miARN et de leurs cibles. Les flèches rouges indiquent les pics ou sites de clivage les plus abondants. (a) miR162-3p ciblant la protéine homologue à l'endonucléase Dicer-1-like ; (b) miR1513a ciblant la kinase histidine activée par la lumière bleue ; (c) miR2118b ciblant la protéine homologue à la phosphoribosyltransférase hypoxanthine-guanine ; (d) miR172c ciblant la protéine transcriptionnelle supposée réactive à l'éthylène RAP-2-7-like ; (e) miR159b-3p ciblant la protéine hypothétique 11M9.5 ; (f) miR166 h-3p ciblant la protéine de type homeobox à leucine zipper ATHB-15-like.

Analyses des voies GO et KEGG

Les cibles des miARN identifiés ont été soumises à une analyse GO et KEGG pour percevoir leurs rôles biologiques. Les gènes cibles sont impliqués dans 47 types de composants cellulaires, 103 types de fonctions moléculaires et 144 types de processus biologiques.

Figure 5. Classifications GO des cibles de miARN dans A. chrysochlorus.

Figure 6. Voie d'interaction plante-pathogène KEGG et miARN connus et nouveaux obtenus dans cette étude, ciblant possiblement les gènes impliqués dans cette voie.

Référence

1. Cakir O, Candar-Cakir B, Zhang B. Le séquençage de petits ARN et du dégradome révèle une fonction importante des microARN dans Astragale chrysochlorus réponse aux stimuli du sélénium. Journal de biotechnologie végétale, 2016, 14(2) : 543-556.