Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS en longueur complète

En termes d'expérience approfondie en séquençage, CD Genomics est fier d'offrir à nos clients des services d'ARNr 16S/18S/ITS en pleine longueur avec la meilleure qualité et les prix les plus compétitifs.

Qu'est-ce que le séquençage d'amplification en longueur complète des gènes 16S/18S/ITS ?

Le gène de l'ARNr 16S est fortement conservé entre différentes espèces de bactéries et d'archées, contenant neuf régions hypervariables (V1-V9) mesurant entre environ 30 et 100 paires de bases, qui varient considérablement entre les bactéries. Les régions hautement conservées permettent aux chercheurs de concevoir des paires d'amorces qui amplifieront de manière précise et fiable la région hypervariable 16S de leur choix afin d'atteindre l'identification ou la caractérisation de diverses communautés bactériennes.

Semblable aux gènes 16S rRNA bactériens, le gène 18S rRNA eucaryote possède des régions conservées et variables. Les séquences du gène 18S rRNA et leurs espaces transcrits associés (espace interne transcrit ; ITS) sont utilisées pour classer les champignons et les eucaryotes.

Basé sur le développement de la technologie de séquençage, Séquençage des gènes d'ARNr 16S/18S/ITS est le meilleur outil pour étudier la taxonomie bactérienne et fongique ainsi que la phylogénie moléculaire. En tirant parti de Séquençage des lectures longues PacBio SMRT technologie, CD Genomics peut fournir un service de séquençage complet des ARNr 16S/18S/ITS pour mieux aider votre recherche.

Le séquençage complet des régions 16S/18S/ITS implique l'extraction de l'ADN microbien d'un échantillon donné, suivie de l'amplification de l'ADNr 16S, de l'ADNr 18S ou de la région ITS dans son intégralité à l'aide de primers universels, puis du séquençage. Cette méthodologie non seulement améliore la précision de l'identification des espèces, grâce à une résolution accrue, mais renforce également l'exactitude dans le déchiffrement de la constitution microbienne au sein des échantillons. Par conséquent, cela offre une vision plus intégrative de la structure de la communauté microbienne.

Avec une résolution aussi élevée, l'accent se déplace naturellement vers des études au niveau des espèces. Cela représente une progression significative par rapport aux études de deuxième génération précédentes centrées sur le niveau du genre et de l'espèce utilisant le 16S. Le 16S de troisième génération en pleine longueur peut fournir une analyse de souche plus complète et complexe, rendant les résultats de recherche globaux plus pertinents pour la fonctionnalité écologique. Cette approche a un impact considérable sur les corrélations multi-omiques et les directives expérimentales et validations ultérieures, lui conférant une signification importante. Du point de vue de la corrélation multi-omique, des données de niveau plus fin révèlent souvent des motifs locaux plus clairs, englobant de nombreux détails qui étaient auparavant soit négligés, soit inaccessibles.

Avantages du séquençage d'amplicons complets de 16S/18S/ITS

• Lectures plus longues pour une précision accrue.
• Résolution et précision d'identification des espèces supérieures.
• Reconstruction plus précise des communautés microbiennes.
• Plateforme de séquençage mature : PacBio SMRT système.
• Assurance de données de haute qualité.
• Identification précise avec plusieurs options pour les lectures CCS.
• Expérience de projet riche.
• Contenu d'analyse diversifié.
• Cycles courts avec des avantages de prix compétitifs.

Applications du séquençage d'amplicons complets 16S/18S/ITS

• Champ médical : Recherche sur la relation entre les maladies courantes et le microbiote humain.
• Domaine animal : Études sur la relation entre l'intestin, le rumen (comme les communautés microbiennes productrices de méthane) et la santé animale/la digestion des nutriments.
• Agricole domaine : Recherche sur la microbiote du rhizosphère et les interactions entre les plantes, ainsi que sur les pratiques de culture/fertilisation agricoles et les communautés microbiennes du sol.
• Environnemental domaines : Enquêtes sur le traitement du brouillard, la gestion des eaux usées, la dégradation du pétrole, le traitement des eaux acides des mines et la recherche sur l'environnement marin.
• Environnements extrêmes spéciaux : Recherche sur les communautés microbiennes dans des conditions environnementales extrêmes.

Flux de travail de séquençage d'amplification en longueur complète de 16S/18S/ITS

Spécification de service

	Exigences d'échantillon : ADN génomique ≥ 500 ng, concentration ≥ 10 ng/µL, OD260/280 = 1,8-2,0 Tissu : 1-3g, Quantité minimum : 1g Thalle : 5 g, Quantité minimale : 3 g Liquide interstitiel : 3-5 mL, Quantité minimale : 1 mL Échantillons environnementaux : 3-5 g, Quantité minimale : 1 g Membrane de filtre à eau : 3, Quantité minimum : 1 Produits PCR ≥400 ng
	Séquençage : Plateformes PacBio Sequel 2000~20000 lectures CCS/par échantillon
	Analyse de données Clustering et filtrage des OTUs Analyse des OTUs et annotation des espèces PCA, diagramme de Venn. Une courbe de classement sera générée en fonction de l'abondance des OTU. Diversité alpha, diversité bêta, méta-analyse Analyse statistique multivariée … (plus sur demande)

Pipeline de bioinformatique

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage des amplicons 16S/18S/ITS en longueur complète pour votre rédaction (personnalisation)

Références :

1. Callahan B J, Wong J, Heiner C, et al. Séquençage d'amplicons à haut débit du gène 16S rRNA complet avec une résolution à un nucléotide. Recherche sur les acides nucléiques, 2019, 47(18) : e103-e103.
2. Lam T Y C, Mei R, Wu Z, et al. Caractérisation de la diversité microbienne dans les digesteurs anaérobies avec une résolution supérieure grâce au séquençage d'amplicons de gène 16S rRNA complet. Recherche sur l'eau, 2020, 178 : 115815.
3. Hui M, Wang A, Cheng J, et al. Le séquençage d'amplicons de l'ARNr 16S en pleine longueur révèle la variation du microbiote épibionte associé à deux espèces de crevettes de la famille des Alvinocarididae : possiblement co-déterminée par l'hétérogénéité environnementale et la reconnaissance spécifique des hôtes. PeerJ, 2022, 10 : e13758.

Utilisation des résultats du séquençage d'amplicons 16S rRNA pour l'affichage. (Hui, et al., 2022)

1. Quels sont les avantages du séquençage d'amplicons de troisième génération ?

Le séquençage d'amplicons de troisième génération offre plusieurs avantages. En tirant parti du Pséquençage de molécules uniques acBio SMRT la technologie, elle fournit des lectures ultra-longues, permettant la couverture des régions complètes de la petite sous-unité ribosomique 16S/18S/ITS. Cela répond au défi technique des produits à courtes lectures, qui sont limités à l'analyse uniquement des régions variables locales. De plus, elle permet une classification et une identification microbiennes véritablement précises à des coûts raisonnables.

2. Pourquoi choisir la diversité microbienne complète ?

La technique de séquençage de deuxième génération analyse principalement des séquences partielles du gène 16S rRNA. Cependant, différents chercheurs analysent différentes régions des gènes 16S rRNA dans diverses bactéries, et le choix des amorces PCR pour les amplicons de courtes lectures de différentes régions hypervariables peut influencer l'exactitude inférée de la communauté et la sensibilité à certains groupes bactériens. Cette situation rend les comparaisons à l'échelle mondiale dans les études sur le microbiome difficiles. De plus, en raison des informations de mutation limitées portées par certaines régions hypervariables, l'annotation au niveau des espèces ne peut pas être réalisée. Par conséquent, la diversité des microbiomes de deuxième génération est généralement étudiée au niveau du genre et au-dessus. En revanche, le séquençage de troisième génération peut mesurer toutes les régions hypervariables en une seule fois. Cette capacité élimine les préférences engendrées par des amorces variées et offre une nouvelle méthode pour améliorer la résolution taxonomique des communautés microbiennes.

3. Comment identifier des espèces bactériennes ?

Comparez les séquences 16S rDNA obtenues aux séquences 16S rDNA de référence sur GenBank ou Eztaxon. Avec plus de 97 % de similarité de séquence, elles peuvent être considérées comme la même espèce bactérienne. Pour une identification plus précise, l'hybridation de l'ADN, la teneur en GC du génome et les indices physiologiques et biochimiques devraient être utilisés.

4. Les exigences pour les échantillons.

Si vous soumettez des microbes cultivés, veuillez vous assurer qu'ils ont été purifiés au moins trois fois. Et veuillez indiquer clairement les conditions de culture. Si un milieu spécial est nécessaire, veuillez le fournir.
Si vous soumettez des échantillons d'ADN génomique, une quantité supérieure à 500 ng est requise.
Pour les microbes Gram-positifs, veuillez soumettre des échantillons d'ADN génomique.

5. Quelle est la longueur totale de la séquence 16S/18S/ITS ?

Le gène de l'ARNr 16S des microbes procaryotes mesure environ 1500 pb de long, englobant dix régions conservées et neuf régions hautement variables (V1-V9). Il présente à la fois un haut niveau de conservatisme et de spécificité, les régions conservées reflétant les relations phylogénétiques entre les genres, et les régions variables illustrant la variation inter-générique. Le gène de l'ARNr 18S des microbes eucaryotes, avec une longueur de séquence variant entre 1500 et 2000 pb, comporte également des régions conservées et variables. En raison de son taux d'évolution conservateur, il est adapté à l'identification taxonomique au niveau des espèces et au-dessus. L'espaceur interne transcrit (ITS) des microbes eucaryotes, d'environ 500 pb de long, conserve un haut niveau de conservatisme entre différentes souches au sein d'une espèce mais subit une variation considérable entre les espèces. Cela le rend extrêmement polychromatique, prouvant son large éventail d'applications dans les études phylogénétiques inter-espèces et la recherche.

Analyse du microbiome intestinal de la souris à l'aide du séquençage d'amplicons 16S rRNA en longueur complète

Journal : Rapports scientifiques
Facteur d'impact : 4,6
Publié : 14 juillet 2016

Résumé

L'avènement de la technologie de séquençage de nouvelle génération a renforcé la clarification détaillée de la composition des communautés microbiennes, offrant une précision et un débit améliorés par rapport aux méthodes précédentes. Les auteurs ont utilisé des plateformes de séquençage par nanopore pour séquencer une bibliothèque d'amplicons 16S rRNA en pleine longueur préparés à partir du microbiote intestinal de souris. Au niveau des espèces, le séquençage par nanopore surpasse le séquençage à courtes lectures dans l'identification de plus d'espèces, contribuant ainsi à une caractérisation précise de la composition des communautés bactériennes.

Méthodes

Résultats

1. Comparaison statistique entre les données de séquençage à lecture courte et celles de séquençage par nanopore.

Le jeu de données de séquençage à lecture courte a été analysé en utilisant l'approche des Unités Taxonomiques Opérationnelles (UTO). D'autre part, la composition de la communauté microbienne a été déterminée sur la base des données de séquençage Nanopore obtenues par une méthode de systématisation, connue sous le nom d'analyse taxonomiquement supervisée, qui attribue directement les séquences dans des catégories taxonomiques en fonction de la similarité des séquences. Malgré le niveau négligeable de phylogénie spécifique aux échantillons observé et le taux d'erreur relativement élevé (20,4 %) identifié à partir des lectures de séquençage Nanopore, une grande reproductibilité et corrélation ont été atteintes entre les réplicats biologiques. Par conséquent, l'application du séquençage d'amplicons Nanopore permet la détection répétée de 34 principaux types de systèmes.

Figure 1. Comparaison statistique entre les données de séquençage à lecture courte et celles de séquençage par nanopore.

2. Comparaison de la composition microbienne déterminée par deux plateformes de séquençage

Les auteurs ont comparé la composition microbienne déterminée à l'aide de deux plateformes de séquençage. Les deux plateformes ont identifié 8 phylums bactériens et 13 classes bactériennes (comme illustré). Il y avait une similitude statistique notable entre le séquençage à lecture courte et le séquençage par nanopore concernant les proportions relatives et les classes des phylums principaux. En général, des similitudes significatives dans la composition bactérienne ont été observées entre les deux plateformes au niveau de l'ordre, de la famille et de l'espèce. D'après l'analyse comparative de la composition microbienne analysée indépendamment via les plateformes de séquençage par nanopore et à lecture courte, il est évident que le séquençage par nanopore peut identifier avec précision la composition microbienne au niveau de l'espèce.

Figure 2. Comparaison des compositions du microbiote intestinal des souris entre deux plateformes de séquençage à des classifications plus approfondies (ordre à espèce).

3. Détection des espèces à l'aide du séquençage d'amplicons de rDNA 16S en longueur complète

En ce qui concerne la résolution taxonomique du niveau du phylum au niveau de l'espèce, les proportions relatives du Groupe I (les deux plateformes de séquençage) et du Groupe III (seulement le séquençage à court terme) ont diminué, tandis que le Groupe II (séquençage par nanopore uniquement) a connu une augmentation. À cet égard, nous postulons que les longues lectures générées par le séquençage par nanopore traversent plusieurs régions hypervariables et, en raison de ses lectures de l'ADNr 16S presque complètes, peuvent surpasser le séquençage Illumina dans la distinction de la structure de la communauté microbienne. Pour déterminer l'impact des longues lectures sur l'analyse de la communauté microbienne au niveau des espèces, nous avons réalisé une analyse phylogénétique sur le jeu de données composite basé sur la priorité et identifié 16 espèces phylogénétiquement distinctes réparties sur 13 genres (comme illustré).

Figure 3. Analyse phylogénétique du microbiote intestinal de la souris.

Conclusion

Les auteurs ont exploré le potentiel du séquenceur de troisième génération, MinION, pour identifier la composition des communautés microbiennes dans des échantillons de fèces de souris. En utilisant le séquençage par nanopores pour le séquençage d'amplicons 16S rRNA en longueur complète, ils ont pu déterminer rapidement, avec précision et efficacité la diversité microbienne au niveau des espèces. Le succès de cette étude dans la clarification de la composition des communautés microbiennes est indicatif du potentiel futur de la méthode. Les auteurs prévoient que cette approche élargira l'applicabilité des analyses de communautés microbiennes dans des contextes biologiques, cliniques et environnementaux.

Référence :

1. Shin J, Lee S, Go M J, et al. Analyse du microbiome intestinal de la souris à l'aide du séquençage d'amplicons 16S rRNA en pleine longueur. Rapports scientifiques, 2016, 6(1) : 29681.