Directives de Soumission d'Échantillons
Aperçu : Qu'est-ce que le séquençage d'ARN direct par nanopore ?
Le séquençage direct de l'ARN par nanopore est la seule méthode qui lit directement les molécules d'ARN natives—sans transcription inverse ni PCR—ce qui permet à vos données de préserver les modifications de bases réelles et les caractéristiques par molécule. Le séquençage se déroule de 3′ à 5′ à partir d'un adaptateur poly(T), produisant des lectures longues de molécules uniques qui couvrent des structures complètes d'UTR 5′–CDS–UTR 3′.
Comment ça fonctionne
- L'ARN Poly(A)+ (ou une capture personnalisée) est préparé et ligaturé à un adaptateur poly(T) à l'aide d'une protéine motrice.
- Translocer à travers le pore : Chaque brin d'ARN est entraîné à travers un nanopore où les variations de courant ionique codent les identités nucléotidiques.
- Décoder et analyser : Le basecalling reconstruit la séquence tandis que les algorithmes sensibles au signal produisent des signatures de modification de l'ARN (m6A/m5C/Ψ/I) et la longueur de la queue poly(A) par lecture.
- L'orientation et la chimie sont documentées dans notre protocole validé de séquençage direct de l'ARN par Nanopore, dans le cadre du flux de travail de séquençage direct de l'ARN par Nanopore.
Pourquoi c'est important
- Isoformes de pleine longueur, sans assemblage : Les longues lectures résolvent directement l'épissage alternatif et les structures de transcrits complexes, réduisant les erreurs d'inférence courantes avec les courtes lectures. RNA-seq.
- Épitranscriptome natif : Parce qu'il n'y a pas de RT/PCR, les véritables modifications chimiques de l'ARN sont conservées et détectables à une résolution proche du niveau de base.
- Biologie du poly(A) : La longueur de la queue poly(A) par lecture permet d'étudier la stabilité, la traduction et la régulation spécifique des isoformes.
- Amplification/GC biais réduit : Les bibliothèques sans PCR améliorent la quantification des ARN à extrêmes de GC et structurés.
Flux de séquençage d'ARN direct par nanopore
1. Échantillon de reçu et contrôle qualité
- ARN total accepté : (recommandé ≥50 µg à ≥180 ng/µL ; utilisable 20–80 µg, dépendant de l'étude).
- Contrôle d'intégrité (Bioanalyzer/TapeStation), dépistage des contaminants, contenu en rRNA ; manipulation sans RNase.
- Contrôles optionnels : ajouts ERCC ; normes de méthylation pour la calibration de l'appelant.
- Recommandation : ≥2 réplicats biologiques par condition (≥3 améliore la puissance).
2. Sélection Poly(A)+ / capture personnalisée
- Standard : enrichissement par oligo-dT pour l'ARNm.
- Options : déplétion d'ARNr ou capture ciblée (par exemple, panneaux lncRNA/circRNA ou sondes spécifiques à un organisme).
3. Préparation de bibliothèque — RNA direct 1D (sans PCR)
- Ligation de l'adaptateur poly(T) et de la protéine motrice ; pas de RT / pas de PCR.
- L'orientation est de 3′→5′ par conception ; la chimie et le codage-barres sont documentés dans notre protocole validé de séquençage Direct RNA Nanopore.
4. Exécution de nanopores et surveillance en temps réel
- Contrôle qualité de la cellule de flux, occupation des pores, suivi du rendement en temps réel.
- Configuration d'exécution correspondante aux cibles de profondeur (taille de l'organisme, complexité, comparaisons).
5. Basecalling et traitement du signal
- FAST5 brut → FASTQ avec métriques de qualité.
- Extraction consciente du signal de la longueur de la queue poly(A) par lecture et des caractéristiques de modification (candidats m6A/m5C/Ψ/I).
6. Gestion de l'alignement et des isoformes
- Alignement épissé guidé par référence.
- Regroupement d'isoformes et dé-duplication pour atténuer la troncature 5' et la multiplicité des molécules ; utilisation des sites poly(A) capturée.
7. Transfert des analyses principales
- Sorties structurées (BAM/CRAM, GTF/GFF, tables poly(A) par lecture, tables de caractéristiques de modification) passées dans les modules d'analyse de séquençage RNA direct Nanopore.
Notes et meilleures pratiques
- Les bibliothèques sans PCR réduisent le biais GC/amp et préservent les modifications d'ARN natives.
- Une certaine troncature à 5′ est attendue ; notre pipeline de regroupement garantit une précision au niveau des isoformes.
- Module d'ARN naissant optionnel : Le marquage 5-EU permet l'identification des transcrits naissants, l'estimation de la demi-vie et les analyses de stabilité.
Plan d'analyse intégré
Analyse bioinformatique du séquençage d'ARN direct par nanopore
I. Analyse des isoformes
- Analyse du splicing alternatif
- Identification de transcrits de fusion
- Analyse de la queue Poly(A)
II. Quantification des expressions
- Quantification des transcrits
- Analyse différentielle des transcrits
- Enrichissement fonctionnel (GO/KEGG/GSEA)
- Réseau d'interaction protéine-protéine (IPP)
III. Analyse de la méthylation / modification de l'ARN
- annotation des sites m6A
- Analyse d'enrichissement des modifications
- Analyse différentielle de m6A
IV. Analyse d'expression quantitative conjointe des isoformes
- Analyse AltTP
- Analyse de la diversité fonctionnelle (ADF)
- Analyse d'enrichissement différentiel
V. Analyse de l'ARNm naissant (optionnel)
- Identification de l'ARNm naissant
- Estimation de la demi-vie
- Analyse de la corrélation de la stabilité de l'ARNm
- Expression nascentielle différentielle
Ce que vous obtiendrez de notre service de séquençage RNA direct par nanopore
Résultats directs d'ARN complets
Jeux de données entièrement traités comprenant FAST5/FASTQ, BAM/CRAM épissés, GTF/GFF (isoformes nouvelles/connues, TSS/TTS, sites poly(A)), tables de queues poly(A), listes de sites de modification de l'ARN (m6A/m5C/Ψ/I), appels de fusion et comptages au niveau des transcrits/TPM—prêts pour une analyse immédiate de séquençage d'ARN direct Nanopore et une utilisation en aval.
Perspectives Différentielles et Fonctionnelles
Résultats spécifiques à la condition englobant des transcrits différentiels, AltTP/DIU, m6A différentiel et comparaisons poly(A), ainsi que l'enrichissement GO/KEGG et des superpositions de réseaux PPI optionnelles pour relier les changements d'isoformes/modifications avec les voies.
Visualisations prêtes pour publication
Figures de haute qualité : cartes thermiques des isoformes, graphiques en volcan, visuels sashimi/AltTP/DIU, panneaux de points de rupture de fusion, vues de métagène/motif de modification, et histogrammes poly(A) - optimisés pour l'interprétation et la soumission à des revues.
Dossiers d'analyse transparents
Un rapport concis sur les Méthodes et le Contrôle Qualité (résumé du protocole Direct RNA 3′→5′, logiciels/versions/paramètres, rendements/qualité de lecture/métriques de cartographie/jonction) avec un manifeste de pipeline, un fichier d'environnement et des sommes de contrôle pour une reproductibilité complète.
Options supplémentaires
Module d'ARN naissant (identification de 5-EU, demi-vie, corrélations de stabilité), multi-omique intégrative (par exemple, profondeur Illumina + caractéristiques de l'ARN direct), stratégies de capture non-poly(A), tableaux de bord HTML interactifs et exports personnalisés (par exemple, prêts pour Cytoscape).
Exigences et expédition des échantillons
| Catégorie | Exigences et Remarques |
|---|---|
| Entrée standard | ARN total: recommandé ≥50 µg à ≥180 ng/µL ; utilisable 20–80 µg (selon l'objectif). Guide des cellulesEnviron 1×10^7 cellules produisent généralement une quantité suffisante d'ARN. type d'ARNARNm Poly(A)+ par défaut ; options non-poly(A) disponibles (capture personnalisée/semblable à NERD). |
| Critères de qualité | Intégrité: RIN ≥7 ou haute DV200. Propreté: éviter le transfert de phénol/EDTA et les inhibiteurs de DNase. |
| Répliques et Contrôles | Répliques≥2 biologiques par condition (≥3 préférés pour différentiel/AltTP). Contrôles (optionnel): Éléments de spike-in ERCC, standards de méthylation (pour la calibration de l'appelant de modification). |
| Soumission et expédition | EmballageTubes sans RNase, clairement étiquetés (ID de projet, ID d'échantillon, concentration, volume). Température: expédier sur de la glace carbonique. Manifeste: inclure des métadonnées d'exemple (organisme, traitement, comparaisons prévues). Conformité: respecter les réglementations internationales sur les biospécimens ; inclure la FDS si nécessaire. |
| Faible apport / Cas spéciaux | Consultez-nous pour des stratégies RNA à faible input, des panneaux de capture ciblée (lncRNA/circRNA), ou des tissus dégradés/archivés (feasibilité au cas par cas). |
Applications et Exemples de Cas
Applications principales
- Transcriptomique résolue par isoforme: isoformes de pleine longueur, épissage alternatif (AltTP/DIU), utilisation des sites TSS/TTS et poly(A).
- Détection de transcrits de fusionpreuve à molécule unique à travers les points de rupture pour des appels à haute confiance.
- Épitranscriptomiquecartographie des modifications d'ARN à l'échelle du transcriptome (m6A/m5C/Ψ/I) avec analyse différentielle.
- Biologie de la queue poly(A)longueur de la queue poly(A) pré-lue pour étudier la stabilité et la traduction ; différences spécifiques aux isoformes.
- ARN naissant et dégradation (optionnel): 5-ARN naissant basé sur l'UE, estimation de la demi-vie, corrélations de stabilité.
- ARN non codantDécouverte/quantification des lncRNA et circRNA avec des lectures longues.
- Annotation du génome: transcriptions/gènes nouveaux dans des organismes non modèles ou des tissus hétérogènes.
- Dynamique longitudinale: changements simultanés dans la structure, l'expression et les modifications au fil du temps ou selon les conditions.
Instantanés de cas
- ARN viralcartographie m6A de niveau de base sur des génomes de pleine longueur pour relier les modifications avec le splicing/les isoformes.
- Modèles de virus de l'hépatitedétection directe de m5C sur les ARN viraux pour explorer les voies d'exportation et de détection innée.
- Oncologiedynamique de la pseudouridine (Ψ) liée au contrôle de la traduction ; transcrits de fusion dans des échantillons tumoraux.
- Réponses des plantes à la lumièreDes lectures en longueur révèlent des événements d'épissage post-transcriptionnel régulés par la lumière.
- États métaboliqueschangements poly(A) spécifiques aux tissus et commutation d'isoformes lors du jeûne/alimentation.
- Physiologie du stressLe profilage sanguin longitudinal montre des changements simultanés dans l'expression et les marques m6A.
Comparaison des méthodes
| Caractéristique | Illumina à lecture courteRNA-seq | ONT cDNA Long-Read (RT/PCR) | ONT RNA direct (Ce service) |
|---|---|---|---|
| Lecture de molécule | fragments d'ADNc | cDNA plein longueur (amplifié) | ARN natif, molécule unique |
| Isoformes de pleine longueur | Inféré/ambigu | Oui | Oui (pas d'assemblage) |
| Biais RT/PCR et effets GC | Présent | Présent (réduit vs SR) | Minimale (sans PCR) |
| Modifications de l'ARN | Indirect/spécifique à l'essai | Perdu pendant RT | Signaux directs m6A/m5C/Ψ/I |
| Longueur de la queue poly(A) | Non accessible | Indirect/non par lecture | Longueurs de queue pré-lues |
| Détection de transcrits de fusion | Défiant (assemblage) | Bon | Haute confiance (lecture unique à travers le point de rupture) |
| Fidélité de quantification | Affecté par la fragmentation/modélisation | Biais RT/PCR possible | Natif, spécifique à la chaîne, biais réduit |
| Débit | Le plus élevé | Modéré | ARNm inférieur vs cDNA (détails par molécule plus élevés) |
| Meilleur pour | Cohortes très larges ; DE au niveau des gènes | Isoformes à haut rendement (sans modifications) | Isoformes + modifications + poly(A) sur les mêmes molécules |
| Utilisation typique | Dépistage d'expression, DE en vrac | Catalogues d'isoformes, UTR longues | Études axées sur les mécanismes : épissage/AltTP, épitranscriptome, stabilité |
Pourquoi CD Genomics ?
1. expertise en ARN natif
ARN direct 1D, sans PCR, orientation 3′→5′ ; protocole de séquençage ARN direct Nanopore validé avec un contrôle qualité rigoureux des échantillons/des courses.
2. Flux de travail et analyse de bout en bout
De l'échantillonnage QC et de la préparation de bibliothèque à la séquençage, analyse de séquençage direct de l'ARN Nanopore, et reporting intégré—isoformes, m6A/m5C/Ψ/I, queue poly(A)set un ARN naissant optionnel.
3. Prouvé dans des recherches évaluées par des pairs
Des bibliothèques d'ARN directes par nanopore préparées par CD Genomics ont été utilisées dans une étude de PLOS Genetics sur Arabidopsis épitranscriptomique, démontrant le cartographie m6A à molécule unique avec DRS (Sun et al., 2022).
4. Qualité et reproductibilité
Méthodes transparentes et rapport de QC, pipelines verrouillés par version, manifestes et sommes de contrôle ; figures prêtes à être publiées et paquets de données réutilisables.
5. Conçu pour votre question
Conception d'étude pour les isoformes/épissage, l'épitrancriptome, la biologie du poly(A), l'ARN naissant ; options pour la capture non-poly(A) et l'intégration multi-plateforme.
Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :
Chaleur de l'expression différentielle des isoformes
Distribution des sites m6A dans les régions transcriptomiques
Diagramme de volcan des isoformes différentiels
Logo du motif de séquence m6A
Couverture de séquence à un locus génétique
Référence:
- Sun, Bin, et al. "La méthylation médiée par FIONA1 de l'UTR 3' de FLC affecte les niveaux de transcrits de FLC et la floraison chez Arabidopsis.. PLoS Génétique 18.9 (2022) : e1010386.
FAQs
Q1. Quand l'ARN direct n'est-il pas le premier choix pour l'analyse ?
Pour des dépistages d'expression différentielle au niveau des gènes à grande échelle avec des budgets serrés, cDNA/Illumina offre généralement plus de profondeur par dollar. Le débit de l'ARN direct est plus faible et le coût par lecture utilisable est plus élevé, il est donc préférable de le réserver aux questions où les caractéristiques de l'ARN natif sont importantes : isoformes de pleine longueur, épissage alternatif, transcrits de fusion, modifications de l'ARN et biologie de la queue poly(A).
Q2. En quoi le séquençage d'ARN direct par Nanopore diffère-t-il du séquençage d'ARN traditionnel ?
La séquençage RNA traditionnel convertit l'ARN en cDNA et l'amplifie par PCR, ce qui peut introduire des biais et supprimer les marques chimiques natives. Les lectures d'ARN directes par nanopore lisent directement les molécules d'ARN natives dans une orientation 3′→5′ sans RT/PCR, préservant les modifications de l'ARN et permettant des mesures de la queue poly(A) par lecture, ainsi que des isoformes de pleine longueur.
Q3. Quels sont les principaux défis de l'ARN direct ?
L'ARN direct a actuellement un débit inférieur à celui du cDNA et un taux d'erreur en lecture unique plus élevé que celui d'Illumina, et il nécessite une analyse spécialisée, consciente des signaux, ainsi qu'un calcul adéquat. En pratique, nous atténuons ces limitations par un design expérimental approprié, un consensus entre les lectures, un alignement robuste et un contrôle qualité minutieux.
Q4. La RNA directe peut-elle effectuer des analyses d'expression génique, d'isoformes de splicing et de transcrits de fusion ?
Oui, à condition que l'étude soit conçue pour ces objectifs. Nous quantifions régulièrement les transcrits, analysons l'utilisation des isoformes (AltTP/DIU) et détectons les transcrits de fusion avec des preuves à molécule unique ; cependant, pour des cohortes très importantes axées uniquement sur l'expression différentielle au niveau des gènes, le cDNA/Illumina peut être plus économique, tandis que l'ARN direct est privilégié pour les études axées sur les mécanismes où les caractéristiques de l'ARN natif sont critiques.
Q5. Les queues poly(A) et les modifications de l'ARN peuvent-elles être profilées dans la même analyse ?
Oui. La longueur de la queue poly(A) et les signatures de modification telles que m6A, m5C et Ψ/inosine sont dérivées du même signal de nanopore sur l'ARN natif, permettant une interprétation conjointe sur les mêmes molécules qui portent les caractéristiques.
Q6. La méthode Direct RNA est-elle spécifique à un brin, et qu'en est-il de la troncature 5′ ?
Les lectures sont intrinsèquement spécifiques à un brin et se déroulent de 3′ à 5′ à partir d'un adaptateur poly(T). Certaines lectures sont tronquées en 5′ par la chimie et la dynamique des pores ; nos étapes de regroupement des isoformes et de dé-duplication tiennent compte de cela afin que les appels au niveau des isoformes restent fiables.
Q7. De quel input ai-je besoin ?
Nous recommandons ≥50 µg d'ARN total à ≥180 ng/µL, avec une plage de travail de 20 à 80 µg en fonction des objectifs et de la qualité ; un ARN intact (par exemple, RIN ≥ 7 ou DV200 élevé) améliore considérablement les résultats. Voir les exigences d'échantillon pour les détails d'expédition et de contrôle qualité.
Q8. Les lectures d'ARN directes Nanopore détectent-elles directement le m6A ?
Oui. Parce que l'ARN natif passe le pore sans RT/PCR, la m6A produit des signatures de courant caractéristiques qui peuvent être enregistrées à une résolution proche du niveau de base et liées à des transcrits et isoformes spécifiques.
Q9. Quelle quantité d'ARN est nécessaire pour le séquençage d'ARN direct ONT ?
La plupart des projets visent ≥50 µg d'ARN total à ≥180 ng/µL ; des études avec 20–80 µg peuvent être réalisables en fonction des objectifs et de l'intégrité de l'ARN, qui influence fortement le rendement et la profondeur d'analyse.
Q10. En quoi l'ARN direct diffère-t-il de l'ARNc en lecture longue ou de l'ARN-seq en lecture courte Illumina ?
Les lectures d'ARN directes lisent l'ARN natif (3′→5′) sans RT/PCR, préservant les modifications de l'ARN et permettant un poly(A) par lecture. Les cDNA/lectures courtes perdent les modifications natives et infèrent les isoformes à partir de fragments.
Mise en avant des publications clients
Journal: PLoS Génétique
Auteur: Sun, B., Bhati, K. K., Song, P., et al.
Publié27 septembre 2022
1) Contexte
Temps de floraison dans Arabidopsis thaliana est étroitement contrôlé par des couches régulatrices d'ARN, y compris la N6-méthyladénosine (m6A). Sun et al.a enquêté sur la question de savoir si l'écrivain m6A FIONA1 (FIO1 ; similaire à METTL16) ajoute des marques de méthylation à l'UTR 3′ de FLC et stabilise ainsi le transcript. Pour obtenir une vue non biaisée et à molécule unique de la méthylation de l'ARN et de la couverture des isoformes, l'équipe a intégré Illumina RNA-seq, MeRIP-seqet le séquençage d'ARN direct par Nanopore (DRS).
2) Méthodes
- Échantillons : 14 jours Arabidopsis thaliana plantes jeunes (WT Col-0 ; fio1-1, fio1-5).
- Préparation de bibliothèque : protocole RNA direct ONT SQK-RNA002 ; bibliothèques préparées par CD Genomics.
- Séquençage : PromethION (R9.4), courses d'environ 48 à 72 h.
- Basecalling/QC : Guppy v3.2.6 ; filtrage avec NanoFilt.
- Alignement et correction : cartographie minimap2 ; correction Fclmr2 ; métriques via samtools.
- appel m6A et statistiques : Tombo (de novo) + MINES ; méthylation différentielle avec methylKit.
3) Résultats
L'analyse de séquençage direct de l'ARN par nanopore a révélé des changements du transcriptome dépendants du génotype et un consensus m6A d'Arabidopsis de RGACH. Dans le type sauvage, la plupart des événements m6A se sont produits à GGACA (34,7 %), suivi de AGACT (27,2 %), GGACT (22,9 %) et GGACC (15,2 %). À travers fio1 mutants, DRS a identifié 74 gènes hypométhylés (fio1-1) et 63 (fio1-5) par rapport au WT. De manière critique, la couverture DRS a confirmé la déplétion de FLC ARNm dans fio1-1 et fio1-5, cohérent avec la perte de la méthylation du 3′UTR.
4) Conclusions
Cette étude démontre comment le séquençage d'ARN direct par nanopore fournit des preuves à l'échelle de la molécule unique et de pleine longueur reliant l'm6A du 3′UTR à la stabilité de l'ARNm. En préservant l'ARN natif, le DRS couple directement la détection des sites m6A, la découverte de motifs et la couverture au niveau des isoformes, résolvant ainsi que FIO1 installe m6A à la FLC 3′UTR, et que la perte de ce marque conduit à une rapide FLC décomposition et floraison précoce.
Analyse de séquençage d'ARN direct.
Voici quelques publications qui ont été publiées avec succès en utilisant nos services ou d'autres services connexes :
La méthylation médiée par FIONA1 de l'UTR 3' de FLC affecte les niveaux de transcript de FLC et la floraison chez Arabidopsis.
Journal : PLoS Génétique
Année : 2022
L'écrivain m6A FIONA1 méthyle l'UTR 3' de FLC et contrôle la floraison chez Arabidopsis.
Journal : bioRxiv
Année : 2022
Séquence génomique complète de l'actinomycète dégradant la lignocellulose Streptomyces albus CAS922
Journal : Annonces de ressources en microbiologie
Année : 2020
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