Séquençage de région ciblée

CD Genomics fournit depuis des décennies un service de séquençage de régions ciblées rapide et abordable. Nous utilisons des instruments de séquençage à la pointe de la technologie pour vous aider à obtenir des informations complètes sur l'ADN des cibles sélectionnées de manière économique, ce qui peut considérablement augmenter à la fois l'étendue et la profondeur de votre recherche en génomique.

L'introduction du séquençage de région ciblée

Le séquençage de régions ciblées est une approche efficace pour étudier vos régions d'intérêt sélectionnées en séquençage de nouvelle générationEn utilisant des panneaux de séquençage de régions ciblées, vous pouvez découvrir des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), des insertions/délétions (InDels), des variations du nombre de copies (CNV) et des variants structurels (SV). Comparé à séquençage du génome entierLe séquençage de région ciblée permet une détection précise des variants rares avec une sensibilité et une spécificité accrues. Cette approche est très rentable lorsqu'il s'agit de traiter un grand nombre d'échantillons, ce qui réduit considérablement le coût par échantillon.

Le processus de séquençage de régions ciblées comprend la conception/synthèse de sondes/amorces, la capture des régions cibles, la construction de la bibliothèque, le séquençage en paires et l'analyse bioinformatique basée sur les séquences cibles. Des ensembles de sondes/amorces spécifiques sont conçus pour enrichir les régions ciblées en utilisant soit des méthodes d'hybridation, soit des méthodes d'amplification. Dans la méthode de capture par hybridation, des sondes d'oligonucléotides biotinylées sont conçues pour cibler des régions d'intérêt au sein d'une bibliothèque de fragments d'ADN. Après une incubation d'hybridation, des billes magnétiques recouvertes de streptavidine sont utilisées pour capturer les hybrides sonde cible biotinylés, ce qui donne une bibliothèque fortement enrichie en ADN ciblé. La méthode d'amplification actuelle repose sur la PCR multiplex ou une forme d'extension d'amorce à travers les régions d'intérêt.

Le séquençage de région ciblée a un large éventail d'applications, y compris :

• Détection des SNPs/InDels/CNVs/SVs
• Découverte de mutations germinales ou somatiques
• Détection et quantification des variants rares et des allèles à faible fréquence
• Analyse de liaison pour les maladies héréditaires
• Découverte de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques

Avantages du séquençage de région ciblée

• Identification des variants à faibles fréquences alléliques (jusqu'à 1%).
• Un ensemble de données plus petit pour l'analyse bioinformatique.
• Coût beaucoup plus bas avec un grand nombre d'échantillons.
• Profondeur élevée (500-1000X, ou plus), permettant l'identification de variantes rares.

Flux de travail de séquençage de région ciblée

CD Genomics utilise des instruments Illumina HiSeq pour fournir un séquençage rapide et précis des régions cibles et une analyse bioinformatique. Nos experts hautement expérimentés mettent en œuvre la gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats de haute qualité. Le flux de travail général pour le séquençage des régions cibles est décrit ci-dessous.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Quantité d'ADN ≥ 10 ng, concentration d'ADN ≥ 1 ng/μl, OD260/280=1,8~2,0. Tous les échantillons d'ADN sont validés pour leur pureté et leur quantité. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage HiSeq plateformes PE150, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400. Profondeur de couverture ≥ 100x ; ≥ 500x est recommandé pour les échantillons de cancer. Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30.
	Analyse bioinformatique Nous proposons des analyses bioinformatiques sur mesure, y compris : Contrôle de la qualité des données brutes Filtrage et alignement Appel et annotation des SNP/InDel/CNV/SV Analyse des mutations somatiques dans le cancer Analyse des maladies complexes Analyse des maladies mendéliennes De nouveau analyse de mutation pour des échantillons familiaux Analyse d'annotation et d'enrichissement DMR (GO/KEGG) Plus d'analyses à votre demande. Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans le séquençage de région ciblée pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose un service complet de séquençage de régions ciblées, incluant la standardisation des échantillons, la conception de sondes/amorces, la capture ciblée, la construction de bibliothèques, le séquençage approfondi, le contrôle de qualité des données brutes et l'analyse bioinformatique. Nous pouvons adapter ce processus à vos intérêts de recherche. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Quelle est la différence entre le séquençage de l'exome complet et le séquençage de régions ciblées ?

Malgré probablement le même principe et le même flux de travail, séquençage de l'exome complet se concentre sur l'exome tandis que le séquençage de région ciblée se concentre sur n'importe quel gène que vous définissez.

2. Que dois-je soumettre ?

Le client qui nécessite le service de région ciblée doit soumettre les échantillons d'ADN ou de tissu, ainsi que la liste des candidats géniques ou la localisation chromosomique de sa région cible. Nous sommes responsables de la génération des sondes, de l'enrichissement de la cible, de la construction de la bibliothèque, du séquençage et de l'analyse bioinformatique.

Nous acceptons les types d'échantillons suivants pour le séquençage de régions ciblées : ADN génomique purifié, amplicons PCR, pellets cellulaires congelés, colonies bactériennes, sections de tissus FFPE (fixés au formol et inclus dans la paraffine), tissus, sang et écouvillons.

3. Quel est le délai de traitement ?

Le séquençage de régions ciblées nécessite des sondes sur mesure, et ces sondes doivent être optimisées davantage pour un enrichissement efficace des régions cibles. Il faut souvent 40 jours de travail pour finaliser la personnalisation des sondes et le séquençage approfondi. Cependant, il existe des solutions commerciales pour le séquençage de régions ciblées, telles que les sondes SeqCap EZ Prime Choice, qui peuvent éliminer le processus de personnalisation des sondes.

4. Comment valider les variantes ?

Variants identifiés grâce à le séquençage de nouvelle génération (NGS) nécessite une confirmation supplémentaire en utilisant soit NGS ou Séquençage de SangerSelon l'enquête réalisée par Coppieters en septembre 2014, près de 70 % des 178 répondants ont indiqué qu'ils validaient actuellement leurs résultats NGS en utilisant le séquençage NGS ou Sanger. Nous validerons les variants en utilisant le séquençage NGS et Sanger.

Figure 1. Un aperçu des méthodes de confirmation des variants (Coppieters et al. 2016).

Référence :

1. Coppieters F, Verniers K, De Leeneer K, et al. Resequencement ciblé et validation des variants à l'aide des tests PCR pxlence. Détection et quantification biomoléculaires, 2016, 6 : 22-26.

Identification d'une nouvelle mutation non-sens de MIP dans une famille chinoise avec des cataractes congénitales par séquençage de capture de région cible
Journal : Scientific Reports
Facteur d'impact : 4,259
Publié : 06 janvier 2017

Résumé

Les auteurs ont recruté une famille chinoise présentant des cataractes congénitales autosomiques dominantes (CCAD). Ils ont trouvé une mutation de substitution non-sens hétérozygote c.634G>C (p.G212R) dans le MIP gène en utilisant le séquençage de la région cible. En conclusion, l'étude a présenté des preuves génétiques et fonctionnelles pour cette nouvelle mutation, qui conduit à une ponctuation corticale progressive congénitale avec ou sans suture en Y. Le proband (II:2) avait un type différent de

Résultats

1. Caractéristiques cliniques

Les auteurs ont étudié une famille chinoise (Figure 1) et ont constaté que le proband (II:2) présentait une cataracte ponctuée, tandis que les autres membres affectés montraient des opacités corticales ponctuées, combinées avec des cataractes en Y. (Figure 2).

Figure 1. Arbre généalogique de la famille. Les carrés et les cercles représentent respectivement les hommes et les femmes. Les symboles noirs désignent les membres affectés, tandis que les symboles ouverts désignent les individus non affectés. La ligne diagonale indique un membre de la famille décédé, et la flèche noire désigne le proband. Les astérisques indiquent les individus séquencés.

Figure 2. Photographies à la lampe à fente des patients. Le proband II:2 (A) présentait une cataracte ponctuée, tandis que son frère cadet II:6 (B) et le fils du frère III:5 (C) présentaient des cataractes en Y associées à des opacités corticales ponctuées.

2. Séquençage de la région cible et analyse des variants

Un panneau de capture sur mesure a été conçu pour capturer 351 gènes de maladies oculaires génétiques, collectés à partir d'OMIM (Connaissances en génétique humaine pour le monde) et des publications littéraires. Les auteurs ont trouvé quatre variantes rares dans les deux échantillons (Tableau 1).

Tableau 1. Variants rares dans les gènes causant des cataractes congénitales.

mutation 3. c.634G>C

Seulement la mutation c.634G>C de la MIP Le gène présentait une nouvelle mutation hétérozygote non-sens, qui changeait la glycine en arginine à la position 212 (p.G212R). L'analyse de ségrégation a révélé que la mutation se segrait bien avec tous les participants affectés et n'était pas détectée chez les membres non affectés ni chez les 100 témoins normaux.

L'analyse de PolyPhen-2 et SIFT a fortement indiqué que la mutation p.G212R est susceptible d'être délétère pour la protéine et pourrait être responsable des cataractes congénitales. Un alignement multiple de séquences a montré que la Glycine à la position 212 de MIP est fortement conservé parmi différentes espèces (Figure 3B).

Figure 3. analyse de mutation du MIP gène.

niveaux d'ARNm et de protéines de WT-MIP et G212R-MIP

Les auteurs ont étudié l'expression du type sauvage. MIP et G212R-MIP dans des cellules HeLa transfectées. Cela a montré que la fluorescence verte dans les cellules HeLa transfectées avec le construct G212R était beaucoup plus faible que celles transfectées avec le construct de type sauvage.

La RT-PCR a été utilisée pour mesurer le niveau de transcription de l'ARN de WT-MIP et G212R-MIP, qui a révélé qu'un parent similaire MIP les niveaux d'expression des ARNm (Figure 4B). Néanmoins, le Western blot a indiqué que les niveaux d'expression des protéines de MIP ont été considérablement réduits dans le G212R-MIP cellules (Figure 4C) en accord avec les résultats de l'analyse par microscopie à fluorescence.

Figure 4. Niveaux d'ARNm et de protéines de WT-MIP et G212R-MIP.

Conclusions

Dans la présente étude, les auteurs suggèrent que la substitution c.634G>C, G212R pourrait contribuer à la pathogénie de l'ADCC dans cette famille chinoise.

Le séquençage de régions cibles est un outil puissant pour le diagnostic clinique d'un groupe hétérogène de troubles monogéniques en raison de ses performances compatibles en matière de couverture de capture, de son coût inférieur et de son délai d'exécution plus court.