Séquençage d'ADN à cellule unique

CD Genomics propose une amplification complète du génome pour découvrir des mutations d'ADN dans des cellules uniques.

L'introduction du séquençage de l'ADN à cellule unique

Des mutations aléatoires et de faible abondance dans le génome des cellules somatiques sont difficiles à qualifier et à caractériser. Pour contourner ce problème et tenir compte de l'hétérogénéité mutationnelle au sein des tissus, le séquençage d'un nombre représentatif de cellules uniques est appliqué.

La technologie d'amplification du génome entier (WGA) a émergé comme un outil pour évaluer les mutations de l'ADN dans une seule cellule ou un nombre limité de cellules. Pour permettre la découverte de véritables variations dans des cellules uniques, l'amplification WGA de l'ADN génomique à copie unique à partir d'une seule cellule est optimisée afin d'obtenir des quantités suffisantes d'ADN pour le séquençage. Confrontés au problème de la quantité d'ADN limitée ou insuffisante pour diverses analyses en aval, l'ADN amplifié peut être utilisé directement pour le séquençage.

Diverses techniques de WGA ont été développées. Nous proposons des services qui copient avec précision l'ADN source original avec le taux de faux positifs le plus bas et un protocole validé bien adapté à la détection des variations du nombre de copies et des variations de nucléotides uniques à travers le génome à partir d'une seule cellule après amplification du génome entier.

Quels sont les avantages du séquençage de l'ADN à cellule unique ?

• La détection directe des mutations au niveau des gènes revêt une grande importance pour la détection des tumeurs.
• L'ADN présente une plus grande stabilité par rapport à l'ARN, offrant ainsi un temps suffisant pour le traitement des échantillons.
• La sensibilité de détection pour identifier des clones cellulaires portant des mutations rares au sein des tissus peut atteindre des niveaux aussi bas que 0,1 %.
• Cette approche s'attaque efficacement au défi posé par les échantillons mixtes.
• De plus, il offre une résolution spatiale améliorée.
• En regardant vers l'avenir, l'intégration d'analyses omiques supplémentaires sur des plateformes d'ADN à cellule unique, y compris le profilage des protéines de surface cellulaire, l'analyse de la méthylation à cellule unique, RNA-seq, et BCR/Séquençage TCR tient une promesse immense.

Quelles sont les applications du séquençage de l'ADN à cellule unique ?

• Pour découvrir des CNVs et des variations de nucléotides uniques (SNVs) à travers le génome dans des cellules uniques ou à très faible apport.
• Pour obtenir une vue base par base d'un exome à résolution unicellulaire.
• Révéler l'hétérogénéité cellulaire
• Suivi du développement embryonnaire et de la différenciation cellulaire
• Investigation du développement tumoral et de la résistance thérapeutique
• Explorer la fonctionnalité du système immunitaire
• Comprendre la structure et la fonction du système nerveux
• Analyse de la composition de la communauté microbienne

Flux de travail de séquençage de l'ADN à cellule unique

L'avènement des technologies de tri/partitionnement des cellules, telles que la cytométrie en flux et la microfluidique, a permis de capturer des cellules uniques, et l'amplification génomique totale (WGA) est optimisée pour fournir des rendements élevés d'ADN génomique complet pour le séquençage. Le flux de travail général pour le séquençage de l'ADN à partir de cellules uniques est décrit ci-dessous.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon Des plaques de 96 puits de suspension de cellules vivantes sont recommandées pour cette procédure. Des cellules congelées dans des lysats congelés spécifiques peuvent également être utilisées comme matériel de départ. >1000 pg d'ADN extrait. Quantité et qualité recommandées des cellules : 1-103Les cellules individuelles sont conservées dans un tampon 1xPBS (sans Ca).2+, Mg2+), le volume est dans une plage de 2 μL Quantité et qualité recommandées de l'ADN ≥ 0,5 pg
	Séquençage HiSeq X Ten Profondeur de couverture ≥ 30x Plus de 85 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse bioinformatique Contrôle de la qualité des données brutes Alignement avec le génome de référence Appel SNP/InDel/SV/CNV Annotation et statistiques Analyse avancée : troubles monogéniques, troubles complexes/multifactorielles et cancer

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse de données
• Détails sur le séquençage à cellule unique pour votre rédaction (personnalisation)

La conférence sur le séquençage de l'ADN unicellulaire de CD Genomics se concentre sur les liens entre la variation cellulaire dans les tissus et la fonction des organes, et éclaire davantage les origines des maladies. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références :

1. Deleye, L et al. Performance de quatre méthodes modernes d'amplification du génome entier pour la détection des variantes de nombre de copies dans des cellules uniques. Rapports scientifiques, 13 juin 2017 ; 7(1) : 3422.
2. Dong, X et al. Identification précise des variants de nucléotides uniques dans des cellules uniques amplifiées par le génome entier. Méthodes NatareMai 2017 ; 14(5) : 491–493.

1. Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN à cellule unique ?

Le séquençage de l'ADN à cellule unique fait référence à une technique sophistiquée Séquençage de l'ADN méthode qui implique l'analyse de matériel génétique prélevé uniquement à partir d'une cellule individuelle. Elle permet aux scientifiques de percevoir et de comprendre les comportements distincts exhibés par chaque cellule.

2. Pourquoi le séquençage de l'ADN à cellule unique est-il important ?

L'importance du séquençage de l'ADN à cellule unique découle de sa capacité intrinsèque à permettre l'étude et l'examen des variations génétiques présentes au sein de cellules individuelles coexistant dans un même tissu ou organisme. La prise de conscience de ces différences peut poser les bases pour mettre en lumière d'éventuelles irrégularités ou anomalies au niveau cellulaire. Par conséquent, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles perspectives sur l'origine et l'évolution des maladies, tout en aidant au développement de modalités de traitement ciblées et efficaces.

3. En quoi le séquençage de l'ADN à cellule unique diffère-t-il des méthodes traditionnelles de séquençage de l'ADN ?

Traditionnel Séquençage de l'ADN Les méthodes amalgament les données génétiques d'une multitude de cellules, obscurcissant ainsi l'hétérogénéité inhérente aux cellules individuelles. En revanche, le séquençage de l'ADN à cellule unique facilite l'examen de cellules singulières, mettant ainsi au jour cette diversité cellulaire cachée.

4. Le principe, les avantages et les inconvénients de l'amplification du génome à partir d'une seule cellule.

i. MDA (Amplification par Déplacement Multiple)

Inventé par Laskin et al. en 2001. Réagi en utilisant des amorces polymères aléatoires de six nucléotides et la polymérase ADN φ29, qui avait de fortes propriétés de remplacement de chaîne et pouvait amplifier le fragment d'ADN de 50 à 100 kb dans des conditions isothermiques. En même temps, en raison de son activité exonucléase 3'-5' et de son activité de correction d'épreuves, la polymérase ADN φ29 a une grande fidélité. La méthode MDA a une couverture génomique plus élevée.

ii. MALBAC (Cycles d'Amplification Basés sur le Recuit Multiple et la Boucle)

Le processus d'amplification quasi-linéaire réduit la préférence de séquence de l'amplification exponentielle. Les amorces amplifiées à 5' contenant la séquence commune de 27 bp et 3' étant une séquence aléatoire de 8 bp, peuvent se combiner avec le modèle à basse température entre 15 et 20 °C, puis amplifier ces amplicons en forme d'anneau après l'amplification quasi-linéaire de 8 à 12 cycles.

L'avantage de la méthode MALBAC est que la préférence de séquence est répétable entre différentes cellules. En raison de sa meilleure homogénéité d'amplification, ses données sont plus adaptées à l'analyse des CNV. La faiblesse de MALBAC est que la fidélité de la polymérase utilisée n'est pas aussi bonne que celle de la polymérase ADN φ29, donc MALBAC aura plus de faux positifs lors de la détection des SNV ; de plus, en raison de sa préférence de séquence répétable, la région d'amplification faible dans le génome est parfois perdue au cours du processus d'amplification.

5. Comment fonctionne le séquençage de l'ADN à cellule unique ?

Isolement cellulaire :

L'isolement de cellules individuelles à partir d'une population hétérogène est réalisé avec précision, en utilisant des techniques sophistiquées telles que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), la microfluidique ou la microdissection par capture laser.

Amplification du génome :

L'ADN extrait de la cellule isolée subit des procédures d'amplification pour produire une quantité suffisante de matériel pour une analyse ultérieure. Des méthodes établies comme l'amplification par déplacement multiple (MDA) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont couramment utilisées à cet effet.

Construction de bibliothèque :

Suite à l'amplification, les molécules d'ADN sont fragmentées et des adaptateurs spécialisés sont introduits pour faciliter les étapes de séquençage suivantes. Cette phase cruciale implique des processus méticuleux, y compris le déchirement de l'ADN, la réparation des extrémités, la ligature des adaptateurs et l'amplification subséquente.

Séquençage de nouvelle génération (NGS) :

Les bibliothèques méticuleusement préparées sont ensuite soumises à la pointe de la technologie. séquençage de nouvelle génération des plateformes telles qu'Illumina, PacBioou Oxford NanoporeLors du séquençage, les fragments d'ADN sont minutieusement lus, fournissant des informations de séquence complètes.

Analyse des données :

Les données de séquençage brutes subissent un traitement et une analyse rigoureux pour identifier les variants génétiques, y compris les variations de nucléotides uniques (SNVs), les variations du nombre de copies (CNVs) et les variations structurelles (SVs). Avancé bioinformatique Des outils et des algorithmes sont utilisés pour l'appel de variants, l'alignement et une interprétation minutieuse.

6. Quelles sont les techniques d'amplification du génome entier ?

Dans le domaine de l'amplification de génome entier, plusieurs voies techniques importantes émergent :

• Une telle voie est ancrée dans la méthodologie PCR, illustrée par le DOP-PCR (PCR à amorces oligonucléotidiques dégénérées).
• Un autre chemin implique des techniques d'amplification isotherme, typifiées par l'amplification par déplacement multiple (MDA).
• De plus, les méthodologies fusionnant la PCR avec l'amplification isotherme, telles que MALBAC (Cycles d'Amplification Basés sur l'Appariement Multiple et le Bouclage), représentent une approche distincte.
• De plus, il existe une catégorie basée sur les mécanismes de transposase, illustrée par LIANTI et META-CS.

La technologie MDA se distingue par sa prévalence et son adoption généralisée dans le domaine de l'amplification de génome entier. De plus, le MALBAC, tirant parti des avantages combinés de la PCR et de l'amplification isotherme, revêt une importance particulière dans des domaines tels que le séquençage de cellules uniques. Bien que LIANTI et META-CS présentent des développements prometteurs dans les approches basées sur la transposase, leur adoption et reconnaissance généralisées n'atteignent pas encore celles de MDA et MALBAC.

7. Quels sont les défis du séquençage de l'ADN à cellule unique ?

Les défis inhérents consistent en la perte potentielle de matériel génétique lors des étapes d'isolement cellulaire et d'extraction de l'ADN, les inexactitudes introduites durant le processus d'amplification, et l'investissement financier considérable requis pour cette technologie.

8. Quelle est la perspective d'avenir pour le séquençage de l'ADN à cellule unique ?

L'avenir est rempli de perspectives pour le séquençage de l'ADN à cellule unique. Les avancées technologiques promettent de réduire les coûts et d'augmenter le débit, favorisant ainsi une utilisation plus large. L'agrégation des données génomiques à cellule unique accélérera également la création de modèles plus sophistiqués du développement humain et de la progression des maladies.

Génomique à haut débit de microbes uniques avec résolution de souche, appliquée à un microbiome intestinal humain

Journal : Science
Facteur d'impact : 60,528
Publié : 3 juin 2022

Contexte

Le microbiome intestinal humain représente un écosystème complexe et individualisé caractérisé par une multitude d'espèces microbiennes. La présence de souches diverses au sein d'une seule espèce peut avoir des effets significatifs sur la santé, notamment en influençant les profils de résistance aux antibiotiques et en modulant les interactions avec le microbiome de l'hôte. Par conséquent, une attention étroite portée sur les espèces microbiennes sans tenir compte de leurs souches spécifiques peut entraîner l'oubli de nuances critiques. Malgré l'importance de la résolution au niveau des souches, la composition génomique du microbiome intestinal à ce niveau reste largement inexplorée, même au sein d'un individu.

Alors que métagénomique par shotgun offre une enquête complète sur les génomes des communautés microbiennes, mais elle ne parvient généralement pas à capturer les variations au niveau des souches. En revanche, les méthodologies basées sur la culture et le séquençage de cellules uniques par plaques de titrage offrent des opportunités pour élucider les génomes résolus par souche. Cependant, ces approches sont limitées par leur capacité restreinte à englober un large éventail de souches microbiennes.

Méthodes

Résultats

Les chercheurs ont utilisé Microbe-seq pour analyser sept échantillons de microbiome intestinal obtenus d'un seul sujet humain, ce qui a permis d'acquérir 21 914 génomes amplifiés uniques (SAGs). Ces SAGs ont été coassemblés en 76 génomes au niveau des espèces, dont beaucoup proviennent d'espèces difficiles à cultiver. Parmi ces génomes, dix espèces comprenaient plusieurs souches, dont les génomes ont également été coassemblés. En utilisant ces génomes résolus par souche, les auteurs ont reconstruit le réseau de transfert horizontal de gènes (HGT) au sein de ce microbiome. Ils ont observé un échange génétique fréquent parmi les espèces de Bacteroidetes, particulièrement associé à un élément mobile abritant un système de sécrétion de type VI, connu pour médiatiser la compétition inter-souches.

De plus, la méthode d'encapsulation par gouttelettes a facilité l'exploration des associations physiques entre des microbes individuels et des bactériophages co-localisés. Notamment, une association hôte-phage significative a été mise en évidence entre le crAssphage, le bactériophage le plus répandu documenté dans le microbiome intestinal humain, et une souche spécifique de Bacteroides vulgatus.

Fig. 1. Schéma du flux de travail Microbe-seq et application dans une communauté de souches bactériennes connues.

Fig. 2. Génomes coassemblés de 76 espèces bactériennes dans le microbiome intestinal d'un seul donneur humain.

Fig. 3. Génomes résolus par souche de B. vulgatus dans le microbiome intestinal humain.

Fig. 4. HGT parmi les souches bactériennes au sein du microbiome intestinal d'un seul donneur.

Conclusion

Les chercheurs ont utilisé Microbe-seq, une méthodologie qui intègre la manipulation de gouttelettes microfluidiques avec une analyse bioinformatique personnalisée, pour mener une exploration résolue par souche de l'architecture génomique au sein du microbiome intestinal d'un individu. Cette approche démontre une polyvalence et peut être facilement adaptée pour étudier divers écosystèmes microbiaux, y compris ceux présents dans les sols et les environnements marins. L'élargissement de l'application de cette méthodologie à une cohorte humaine plus large et l'intégration de Microbe-seq avec des techniques complémentaires telles que le criblage fonctionnel, le tri et le séquençage long-read promettent d'améliorer considérablement notre compréhension du microbiome intestinal et de ses interactions complexes avec la santé humaine.

Référence:

1. Zheng W, Zhao S, Yin Y, et al. Génétique à haut débit de microbes uniques avec résolution de souche, appliquée à un microbiome intestinal humain. Science, 2022, 376(6597): eabm1483.