Séquençage bisulfite ciblé

En tant que fournisseur de premier plan de NGS En tant que partenaire d'Illumina, CD Genomics est dédié à fournir un portefeuille de solutions pour les études épigénétiques. Caractérisé par des exigences de petite taille d'échantillon, une haute résolution, une efficacité et une économie, le séquençage bisulfite ciblé constitue un outil viable pour l'analyse du statut de méthylation des régions génomiques ciblées. Forts de plus de 10 ans d'expérience professionnelle, nous pouvons totalement répondre à vos exigences de projet et à vos budgets dans l'exploration du méthylome.

L'introduction du séquençage bisulfite ciblé

La méthylation de l'ADN, qui se produit le plus souvent au niveau des cytosines dans les sites CpG, joue un rôle important dans l'expression et la régulation des gènes. La capacité à détecter et évaluer la méthylation de l'ADN de manière précise et efficace contribue à améliorer notre compréhension de la méthylation de l'ADN dans le développement et la maladie. Alors que le séquençage bisulfite de tout le génome identifie les cytosines méthylées à l'échelle du génome entier, le séquençage bisulfite ciblé est une technologie précise, efficace et économique pour l'analyse de la méthylation de l'ADN dans des régions cibles, qui peut inclure une étape basée sur l'hybridation sur des plateformes contenant des oligonucléotides préconçus qui capturent les îlots CpG, les promoteurs de gènes et d'autres régions méthylées significatives, ou une étape basée sur la PCR pour amplifier plusieurs régions d'ADN converties par bisulfite en une seule réaction. Il existe des bibliothèques de capture conçues commercialement avec une gamme de caractéristiques épigénétiques qui couvrent environ 12 % à 24 % de tous les CpG du génome. De plus, des amorces spécifiques sont conçues pour capturer la région d'intérêt et évaluer les changements de méthylation de l'ADN spécifiques au site.

Avantages du séquençage bisulfite ciblé

• Mappage de la méthylation de l'ADN à résolution d'une seule base dans des régions sélectives.
• Précision et sensibilité améliorées tout en réduisant vos coûts globaux.
• Permettant une meilleure détermination à la fois des SNP et des événements de statut de méthylation.
• Fournir une meilleure compréhension du développement et de la maladie.

Application du séquençage bisulfite ciblé

• Recherche sur les mécanismes de régulation des gènes
• Dépistage des marqueurs de méthylation
• Validation de la méthylation
• Recherche en élevage animal et végétal
• Études de méthylation cliniques à grande échelle et multi-sites

Flux de travail de séquençage bisulfite ciblé

Notre équipe d'experts hautement expérimentés et notre contrôle qualité strict à chaque étape garantissent des résultats complets et précis. Dans le cadre du séquençage ciblé au bisulfite, l'ADN génomique est converti en bisulfite et amplifié en multiplex à l'aide de primers ou de sondes spécifiquement conçus et validés, les amplicons sont regroupés par le biais de codes-barres et d'adaptateurs. Les bibliothèques d'amplicons sont ensuite soumises au séquençage sur les plateformes Illumina HiSeq.

Spécifications du service

	Exigences et préparation des échantillons Sources d'échantillons comprenant des humains, des animaux, des plantes et des micro-organismes. ADN génomique : Quantité recommandée ≥ 500 ng ; Quantité minimale : 50 ng concentration ≥ 10 ng/µl, OD260/280 = 1,8 ~ 2,0 Cellule : Quantité recommandée ≥ 1×106 Tissu : Quantité recommandée ≥ 20 mg Le protocole de préparation d'échantillons inclut probablement l'extraction de l'ADN génomique, la purification, la quantification, le contrôle de qualité, etc.
	Séquençage Plateformes Illumina HiSeq, paired-end 150 pb Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30 Profondeur de séquençage > 100X
	Analyse des données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Statistiques de données brutes Alignement par rapport au génome de référence Prédiction des sites de méthylation et catégorisation CG, CHG, CHH Estimation du niveau de méthylation de l'ADN et tendance de distribution Niveau de 5mC dans différents éléments structuraux des gènes Identification des régions méthylées différemment Annotation fonctionnelle des gènes proches des régions différentiellement méthylées Analyse différentielle de la méthylation multi-échantillons

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage bisulfite ciblé pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics fournit des services d'analyses bioinformatiques intégrées et de données de haute qualité pour le séquençage bisulfite ciblé, y compris la conversion au bisulfite, la conception et la validation de primers/probes, l'hybridation/l'amplification PCR, la préparation de bibliothèques, le séquençage ADN et l'analyse des données. CD Genomics utilise à la fois des matrices de capture conçues commercialement et des bibliothèques de capture sur mesure pour répondre pleinement à vos objectifs de recherche. N'hésitez pas à nous contacter pour plus d'informations. Nous sommes impatients de collaborer avec vous dans un avenir proche.

Référence :

1. Ziller M. J. et al. Séquençage bisulfite ciblé du méthylome dynamique de l'ADN. Épigénétique et chromatine, 2016, 9(1) : 55.

1. Quand devriez-vous choisir le séquençage bisulfite ciblé ?

La technologie de séquençage par bisulfite ciblé combine la conversion par bisulfite avec l'amplification ciblée de régions d'intérêt, et le séquençage de nouvelle générationC'est un outil rapide et efficace pour l'analyse de régions génomiques ciblées allant jusqu'à 10 kb dans jusqu'à 96 échantillons à la fois. Les résultats offrent une quantification absolue de la méthylation de la cytosine avec une résolution à un seul nucléotide. De plus, cette méthode peut être utilisée pour confirmer les résultats obtenus à partir de séquençage bisulfite de tout le génome, séquençage bisulfite à représentation réduite, et séquençage par immunoprécipitation de l'ADN méthyléLe séquençage bisulfite ciblé permet une meilleure détermination des SNP et des événements de statut de méthylation, ainsi qu'une meilleure compréhension des maladies humaines.

2. Quels sont les avantages du séquençage par bisulfite ciblé par rapport à d'autres technologies de séquençage de la méthylation ?

Comparé aux études de profilage de la méthylation du génome entier, la détection de la méthylation uniquement dans des régions candidates sélectionnées est une approche plus viable qui rend l'analyse de la méthylation plus réalisable et accessible dans différents contextes. Le séquençage bisulfite ciblé augmente considérablement le débit des données et réduit les coûts. Parallèlement, il est également capable de détecter l'état de méthylation de régions qui ne peuvent pas être détectées par RRBS (séquençage bisulfite à représentation réduite) ou immunoprécipitation Les approches. Le séquençage bisulfite ciblé a été largement appliqué au séquençage de méthylation et à la validation de grandes cohortes d'échantillons dans des régions cibles.

3. Comment concevoir des sondes ou des amorces appropriées ?

Une application réussie du séquençage bisulfite ciblé dépend en grande partie de la conception appropriée des sondes et des amorces. Il existe de nombreux outils efficaces pour générer des sondes ou des amorces de manière automatique, tels que ppDesigner (http://genome-tech.ucsd.edu/public/Gen2_BSPP/ppDesigner/ppDesigner.php) et PRIMEGENSw3 (http://primegens.org). Après avoir obtenu de nombreux candidats sondes ou candidats amorces, le processus de validation est important pour sélectionner les plus optimaux.

4. Quel est le flux de travail du séquençage bisulfite ciblé ?

Le flux de travail du séquençage bisulfite ciblé basé sur la PCR est illustré dans la Figure 1. En ce qui concerne le séquençage bisulfite ciblé basé sur l'hybridation, il peut être réalisé soit par conversion au bisulfite de l'ADN natif sélectionné par hybridation, soit par sélection hybride de l'ADN converti. Cette dernière approche est désormais disponible commercialement, caractérisée par une spécificité de cible supérieure, des exigences d'entrée en ADN plus faibles et la capacité de distinguer une conversion de C en U par bisulfite d'un SNP de C en T.

Figure 1. Le flux de travail du séquençage bisulfite ciblé basé sur la PCR.

Le séquençage de méthylation ciblé révèle un signalement Wnt dysrégulé dans la maladie de Parkinson.

Journal : Journal de Génétique et de Génomique

Facteur d'impact : 4,051

Publié : 20 octobre 2016

Contexte

Les facteurs environnementaux et génétiques jouent des rôles cruciaux dans l'étiologie de la maladie de Parkinson. Pour l'instant, nous avons compris qu'un certain nombre de toxines environnementales facilitent le parkinsonisme chez les humains et les animaux. Néanmoins, nous n'avons aucune idée de l'interaction potentielle entre l'environnement et la génétique dans la pathogénie de Parkinson. Par conséquent, Zhang et al. appliquent à la fois le séquençage ciblé par bisulfite et des méthodes d'immunohistochimie pour étudier les liens sous-jacents.

Méthodes

Résultats

Le séquençage bisulfite ciblé a révélé une augmentation de la méthylation des gènes dans la signalisation Wnt.

Ils ont conçu un ensemble d'environ 97 000 sondes de cadenas couvrant 16 379 régions de méthylation différentielle validées des tissus (T-DMR), tous les gènes imprimés humains connus et prédits, ainsi que les sites de début de transcription de tous les gènes sur le chromosome X. L'analyse de clustering K-moyennes a abouti à 336 DMR non chevauchants, parmi lesquels étaient cartographiés des gènes connus. La majorité de ces régions (230/233) a montré des niveaux de méthylation élevés dans les tissus cérébraux PD par rapport aux donneurs sains. Il y a un enrichissement significatif de gènes impliqués dans la signalisation Wnt et la neurogenèse.

2. Détection réduite des gènes dans la signalisation Wnt dans la substantia nigra des patients atteints de la maladie de Parkinson.

Les niveaux de Foxc1, Ngn2, Spry1 et β-caténine dans les neurones DA du mésencéphale étaient notablement réduits chez les patients atteints de la maladie de Parkinson (PD) par rapport à ceux des témoins appariés. L'analyse quantitative a révélé une augmentation significative du nombre de cellules avec une expression réduite ou non détectable de ces gènes. En revanche, le niveau de NEDD8 dans les neurones DA des patients PD et des témoins restait similaire, suggérant que la réduction de la détection de ces protéines dans les neurones DA du mésencéphale des patients PD est spécifique. Des observations similaires ont été faites sur Foxc1 et Spry1 dans les tissus corticaux des patients PD et de leurs témoins appariés. Cependant, peu de changements de Ngn2 et β-caténine ont été détectés dans les tissus corticaux des patients PD et de leurs témoins appariés.

3. Régulation à la baisse de la signalisation Wnt dans les cellules traitées avec le neurotoxique PD MPP+

L'analyse d'annotation fonctionnelle par traitement MPP+ indique un enrichissement des gènes régulés à la hausse fonctionnant dans les liaisons disulfure, la membrane cellulaire, les processus du système neurologique, la réponse de défense, l'adhésion cellulaire, la régulation positive de l'apoptose et la régulation de la migration. Les clusters d'annotation régulés à la baisse induits par MPP+ comprennent des gènes fonctionnant dans les liaisons disulfure, sécrétés, matrice extracellulaire, membrane plasmique, signalisation Wnt et signalisation hedgehog. Les résultats soutiennent davantage l'idée que la signalisation Wnt est altérée dans le parkinsonisme induit par des neurotoxines.

Référence :

1. Zhang L, Jie D, Qian P, et al. Le séquençage de méthylation ciblé révèle une signalisation Wnt dysrégulée dans la maladie de Parkinson. Journal de Génétique et de Génomique, 2016, 43(10):587-592.