Séquençage de dépistage d'anticorps (Dépistage de bibliothèque d'affichage de phages)

CD Genomics s'engage à offrir des solutions avancées. séquençage de nouvelle génération (NGS) stratégie pour aider les chercheurs à dépister les bibliothèques de phages affichés de manière à haut débit, vous permettant de préserver la diversité des bibliothèques d'anticorps et de sélectionner rapidement la pluralité des anticorps apparentés ainsi que des phages rares dans une grande population qui peuvent être récupérés et testés pour leur activité.

Qu'est-ce qu'une bibliothèque de phages à affichage ?

Une bibliothèque de phages affichés est un outil utilisé en biologie moléculaire qui consiste en une vaste collection de bactériophages, qui sont des virus infectant spécifiquement les bactéries. Chaque phage de la bibliothèque est conçu pour présenter un peptide ou un fragment de protéine unique à sa surface. En affichant ces peptides ou protéines, les chercheurs peuvent tester systématiquement lesquels se lient à une molécule cible spécifique, telle qu'une protéine ou un antigène d'intérêt. Ce processus permet aux scientifiques d'identifier et d'isoler ceux ayant une forte affinité pour la cible, en faisant une technique puissante pour découvrir de nouveaux anticorps, développer des diagnostics et explorer les interactions protéiques.

Introduction au criblage de bibliothèques de phages

L'affichage de phages est une technique de laboratoire puissante et largement utilisée pour identifier des peptides qui se lient à des cibles spécifiques. Cette méthode repose fondamentalement sur une bibliothèque composée de millions, voire de milliards, de particules de phages, chacune exprimant une vaste gamme de peptides exogènes fusionnés à des protéines de capside de phage. Pour isoler des ligands à haute affinité et à haute spécificité, plusieurs cycles de sélection, également connus sous le nom de biopanning, sont réalisés. Ce processus réduit la bibliothèque hautement diversifiée à quelques composés principaux et nécessite une amplification pour enrichir les clones de phages présentant des peptides de liaison à la cible. L'affichage de phages est particulièrement crucial dans la découverte et l'ingénierie d'anticorps, car les fragments d'anticorps (tels que scFv ou Fab) peuvent être facilement exprimés et affichés à la surface des phages.

Le cœur de l'affichage de phages est l'analyse des séquences peptidiques présentes dans la bibliothèque. Traditionnellement Séquençage de Sanger nécessite l'isolement de l'ADN à partir de clones de phages individuels, une méthodologie laborieuse et à petite échelle reposant sur une amplification répétée. Cette approche est limitée par son incapacité à traiter plus d'une centaine de clones de bibliothèque et peut introduire des biais imprévisibles envers certaines séquences d'anticorps dans les bactéries.

Le séquençage profond Illumina offre des avantages substantiels pour l'analyse des écrans de phage display, en particulier pour les collections de séquences complètes. Il permet de réduire le nombre de cycles de sélection et peut potentiellement identifier des ligands en un seul cycle, atténuant ainsi les problèmes de biais inutiles et d'effondrement de la diversité introduits lors de l'amplification. Ainsi, il facilite la découverte de ligands qui auraient pu être précédemment négligés ou sous-représentés dans les études de phage display. De plus, les plateformes de NGS peuvent caractériser jusqu'à 10^6-10^8 séquences en une seule course, offrant une couverture de contenu plus représentative et significative. La stratégie de séquençage des bibliothèques de phages utilisant le NGS est illustrée dans la Figure 1.

Figure 1. Flux de travail du dépistage d'anticorps à partir d'une bibliothèque d'affichage de phages par NGS.

Nos spécialistes peuvent vous guider dans la conception des amorces PCR qui contiennent des séquences flanquant la région variable, des adaptateurs et des codes-barres pour l'enrichissement de candidats spécifiques de la manière la plus efficace. De plus, nous avons développé un pipeline d'analyse bioinformatique qui est bien adapté à l'analyse des séquences d'anticorps pour améliorer la découverte.

Avantages de notre service de dépistage de bibliothèque de phages

• Précision considérableLe séquençage ultra-profond offre une couverture élevée et des données de haute qualité.
• Sélection rapideLe tour de sélection peut être réduit à un seul tour.
• Caractérisation de l'affinité et de la stabilité des anticorpsDes données étendues offrent une compréhension plus approfondie.
• RentablePlusieurs échantillons complexes peuvent être testés en parallèle, ce qui permet de réduire le coût par échantillon.
• Soutien completNous avons une équipe composée de spécialistes dans le domaine des anticorps et du NGS.

Applications du criblage de bibliothèques de phages

• Développement de réactifs diagnostiques : Identification des séquences scFv pour le développement de tests diagnostiques sensibles et spécifiques.
• Développement de produits de thérapie cellulaire immunitaire : Construction de vecteurs CAR-T et CAR-NK pour une immunothérapie ciblée dans des maladies comme le cancer.
• Traitement des maladies : Utilisation des scFvs dans le traitement des cancers, des maladies auto-immunes et de la dégénérescence maculaire liée à l'âge.

Flux de travail de criblage de bibliothèque de phages

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Nous acceptons l'ADN de vecteur phagemide mixte, des phages purifiés, ainsi que des amplicons contenant des domaines lourds et légers variables d'un anticorps. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Illumina HiSeq 50 pb ou 100 pb en simple sens
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité de la séquence Élagage des séquences de faible qualité Assemblage de séquences Alignement de séquences Classification des variantes d'anticorps Prédiction de l'affinité des anticorps Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le dépistage de la bibliothèque d'affichage de phages pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose des services complets de séquençage de dépistage d'anticorps (dépistage de bibliothèque de phages) conçus pour soutenir la découverte et la caractérisation d'anticorps spécifiques. Nos plateformes avancées permettent la construction efficace de bibliothèques de phages et le séquençage à haut débit subséquent pour identifier et valider les candidats anticorps. Nous offrons des solutions de bout en bout, y compris la construction de bibliothèques de phages, le dépistage d'anticorps et l'analyse des séquences. Grâce à nos technologies de pointe, nous garantissons une identification précise et rapide des séquences d'anticorps, vous aidant à rationaliser vos processus de recherche et développement. Pour toute demande spécifique ou toute question supplémentaire, notre équipe est prête à vous assister.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

1. Quelles sont les différences entre la préparation d'anticorps à chaîne unique à l'aide de bibliothèques de phages et les méthodes traditionnelles de préparation d'anticorps ?

Lors de la comparaison des méthodologies de criblage de bibliothèques de phages pour les fragments variables à chaîne unique (scFv) avec la technique traditionnelle des hybridomes pour la production d'anticorps, plusieurs distinctions clés apparaissent.

(1) Criblage de Bibliothèque de Phages:

Avantages :

• Efficacité dans la simulation des réponses immunitaires : La technique de phage display peut simuler le processus de production d'anticorps du système immunitaire animal, offrant plusieurs avantages uniques difficiles à égaler par la technologie des hybridomes. Notamment, le phage display ne nécessite pas d'immunisation. En théorie, une taille de bibliothèque allant de 10^8 à 10^10 peut englober l'ensemble de la gamme des anticorps possibles.
• Dépistage direct et expression rapide : Des anticorps spécifiques peuvent être directement dépistés à partir de bibliothèques d'anticorps d'animaux non immunisés en utilisant des antigènes. Les clones positifs identifiés peuvent ensuite être recombinés dans des vecteurs d'expression plasmidique, permettant l'expression directe de molécules d'anticorps fonctionnels dans Escherichia coli ou des cellules eucaryotes. Le processus est relativement rapide, prenant généralement 16 à 20 semaines pour construire et dépister une bibliothèque d'anticorps naturels.

Inconvénients :

• Considérations sur l'affinité : L'affinité des anticorps scFv obtenus par affichage de phages est souvent inférieure ou comparable à celle des anticorps complets dérivés des techniques traditionnelles d'hybridome. Cependant, cet inconvénient peut être atténué s'il n'entrave pas la reconnaissance des échantillons endogènes ou la préservation des structures secondaires et tertiaires.

Préparation d'anticorps traditionnelle basée sur les hybridomes:

Avantages :

• Maturation de l'affinité et stabilité : Après plusieurs immunisations, les animaux génèrent des anticorps à affinité mature. Les lymphocytes B de ces animaux sont ensuite fusionnés et soumis à des dépistages sous-clonaux répétés pour obtenir des lignées cellulaires d'hybridomes capables de sécréter de manière stable des anticorps spécifiques. Cette méthode produit des anticorps naturels de pleine longueur avec une affinité plus élevée par rapport aux anticorps scFv issus des bibliothèques d'affichage de phages.
• Applicabilité large et cohérence : Les anticorps résultants des techniques d'hybridome sont largement applicables à différents types d'expérimentations et présentent une variation minimale d'un lot à l'autre.

Inconvénients :

• Délai prolongé : La durée du processus est considérablement plus longue. De la préparation de l'antigène à l'acquisition d'anticorps monoclonaux, au moins cinq mois sont nécessaires.

2. Pourquoi y a-t-il une réactivité croisée entre le surnageant de phages des clones positifs et la détection par ELISA avec étiquette ?

Le titre de phage dans le surnageant des clones positifs est généralement très élevé, comme le montrent les tests positifs précédents. Même lorsqu'il est dilué par 10 ou 100 fois, les lectures de l'OD (densité optique) peuvent encore atteindre environ 2,0. Cela suggère qu'une petite quantité d'adsorption non spécifique est tout à fait normale.

Lors du processus de biopanning, les phages qui se lient à la cible sont sélectionnés, mais seuls quelques clones sont identifiés comme positifs après le dépistage ELISA. Le phénomène de réactivité croisée dans le test ELISA peut être attribué à plusieurs facteurs. Plus particulièrement, il se produit dans l'équilibre précis des concentrations d'antigène et d'anticorps. Pour l'ELISA indirect, en particulier, l'antigène et l'anticorps doivent être à des concentrations appropriées pour minimiser les liaisons non spécifiques. Des concentrations élevées de l'un ou l'autre des composants peuvent aggraver les interactions non spécifiques, conduisant à ce qui apparaît comme une réactivité croisée.

En résumé, le titre élevé de phages, associé à des équilibres de concentration antigène-anticorps suboptimaux, contribue à l'adsorption non spécifique et à la réactivité croisée observée dans la détection par ELISA avec étiquette.

Sélection et caractérisation d'anticorps monoclonaux ciblant YKL-40 à partir de bibliothèques de phages Fab synthétiques humains

Journal : Ingénierie biomédicale de la nature

Facteur d'impact : 29,2

Publié : 09 octobre 2023

Contexte

Essais massivement parallèles et NGS améliorer le débit et la vitesse dans la recherche biomédicale, crucial pour la découverte d'anticorps et d'autres biomolécules. Cependant, les méthodes de sélection traditionnelles et le séquençage de nouvelle génération (NGS) à elles seules peuvent souffrir de biais et d'inefficacités. La méthode de "deep screening" intègre le NGS avec un criblage fonctionnel pour identifier efficacement des anticorps à haute affinité à partir de grandes bibliothèques, accélérant la découverte de plusieurs mois à quelques jours et améliorant les performances grâce à l'apprentissage automatique.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans cette étude de preuve de concept, un criblage approfondi a été appliqué à une bibliothèque d'affichage de levures pour la découverte rapide de ligands à haute affinité. Après des étapes de pré-sélection, la méthode a combiné un séquençage extensif et un criblage fonctionnel pour identifier respectivement 47 et 53 candidats uniques issus des sélections MACS et FACS. La technique a démontré son efficacité à corréler des signaux de fluorescence élevés avec des affinités de liaison à faible nanomolaire et a révélé l'avantage du criblage approfondi en fournissant une vue d'ensemble complète des performances de la bibliothèque, surmontant certains biais inhérents aux méthodes de sélection traditionnelles.

Fig. 1 : Criblage approfondi d'une bibliothèque pré-sélectionnée par affichage de levures.

L'étude démontre que le criblage approfondi peut découvrir efficacement des anticorps à haute affinité directement à partir d'une bibliothèque de scFv non sélectionnée. En appliquant cette approche à une bibliothèque dérivée d'un candidat principal, IL70001, les chercheurs ont identifié plusieurs Fabs à affinité élevée en picomolaire contre l'interleukine-7 humaine, atteignant jusqu'à 2 300 fois l'amélioration par rapport à l'anticorps parent. Le criblage approfondi contourne les biais de pré-sélection, offrant une voie rapide et directe vers des anticorps à haute affinité, avec des propriétés prometteuses pour un développement ultérieur.

Fig. 2 : Criblage approfondi d'une bibliothèque de scFv non sélectionnée.

Conclusion

Le dépistage approfondi est une méthode à haut débit utilisant le séquençage avancé pour trouver directement des anticorps à haute affinité à partir de bibliothèques non sélectionnées. Il améliore l'affinité et la puissance jusqu'à 10 000 fois en seulement trois jours, fournissant des données numériques détaillées sur les interactions des anticorps et soutenant la découverte efficace de clones rares à haute affinité.

Référence

1. Porebski B T, Balmforth M, Browne G, et al. Découverte rapide d'anticorps à haute affinité par séquençage massif parallèle, affichage de ribosomes et criblage d'affinité. Ingénierie biomédicale de la nature, 2024, 8(3) : 214-232.