Directives de Soumission d'Échantillons
Pourquoi le séquençage par nanopores ultra-longs est important
Le séquençage conventionnel laisse souvent des lacunes non résolues, en particulier dans les génomes avec des répétitions étendues, de la polyploïdie ou une complexité structurelle élevée. Ces lacunes limitent la précision des assemblages génomiques et réduisent la confiance dans les analyses en aval.
Séquençage ultra long par nanopore adresse ces limitations en générant des lectures d'ADN beaucoup plus longues que les approches standard. Contrairement au séquençage de courte ou moyenne longueur, qui a du mal avec les régions hautement répétitives, les lectures ultra longues peuvent couvrir les centromères, les télomères et les variants structurels en un seul segment.
Cette capacité a transformé la recherche génomique. Les études sur les plantes et les animaux atteignent désormais régulièrement assemblages telomère à telomère (T2T), permettant aux chercheurs d'explorer l'architecture génétique avec une résolution sans précédent. Pour la recherche appliquée en amélioration des cultures, en découverte biomédicale et en évolution microbienne, la capacité à résoudre des génomes complets offre un avantage concurrentiel direct.
Le séquençage du génome entier révèle des facteurs de virulence, des éléments génétiques mobiles et une transmission environnementale potentielle des souches bactériennes dans les exploitations bovines. (Rivu, Supantha, et al., 2024)
Paramètres techniques
| Paramètre | Spécification |
|---|---|
| Longueur de lecture | N50 >50–100 ko ; lectures maximales >4 Mo |
| Exigence d'entrée | ≥6 millions de cellules (PBMC, cellules cultivées ou tissu congelé) |
| Chimie | Kit de séquençage ultra-long Nanopore (SQK-ULK114, Kit 14, nanopore R10.4.1) |
| Plateforme | PromethION / GridION |
| Débit | Jusqu'à 90–100 Go par cellule de flux PromethION |
| Précision | Lecture brute Q20+ (chimie Kit 14) |
| Temps de préparation | ~200 minutes plus élution nocturne |
| méthodes de contrôle qualité | Qubit, Nanodrop, électrophorèse en champ pulsé (PFGE) |
| Stockage et logistique | Kits expédiés à 2–8 °C ; stockage à long terme à –20 °C |
Avantage : Points forts du service CD Genomics
CD Genomics fournit un service de séquençage ultra long par nanopore de bout en bout qui combine des protocoles de laboratoire avancés avec des plateformes de séquençage éprouvées. Notre approche est conçue pour maximiser la longueur de lecture, la stabilité et la précision, permettant aux chercheurs de combler les lacunes et de produire des assemblages hautement contigus.
Avantages clés du service
- Assemblages sans interruption : Le séquençage d'ADN ultra long par nanopore couvre des régions répétitives et riches en GC, éliminant les lacunes d'assemblage.
- Découverte de variants structurels : Les longues lectures détectent avec confiance de grandes insertions, des délétions, des inversions et des expansions de répétitions.
- Résolution du génome polyploïde : des stratégies optimisées valident le phasage des haplotypes dans des espèces complexes.
- Analyse telomère à telomère : Le séquençage à lecture longue par nanopore soutient des assemblages T2T complets chez les plantes et les animaux.
- Chimie optimisée : L'utilisation du Kit de Séquençage Ultra-Long Nanopore (SQK-ULK114) avec le Kit 14 garantit un rendement élevé et une qualité de lecture brute Q20+.
- Applications flexibles : Compatibles avec l'ADN génomique et intégrées aux solutions de séquençage RNA par nanopore en aval.
- SOPs propriétaires pour l'extraction d'ADN à ultra-haut poids moléculaire à partir d'échantillons de plantes, d'animaux et de micro-organismes.
- Améliorations des flux de travail dans la réparation de l'ADN et la construction de bibliothèques qui préservent une longueur de fragment >100 kb.
- Accès aux plateformes PromethION et GridION avec la dernière chimie Kit 14 pour une précision Q20+.
Preuves de cas prouvées
| Projet | Stratégie / Sortie de données | Résultats clés |
|---|---|---|
| Assemblage du génome du blé | HiFi + ONT lectures ultra longues | Le N50 des contigs est passé de 341 kb à 2,15 Mb ; une référence presque sans lacunes a été obtenue. |
| Validation du génome de la canne à sucre | Lectures de nanopores ultra longues pour la vérification des haplotypes | Taux d'erreur de commutation aussi bas que 0,05/Mb ; >90 % de précision de cartographie |
| Génome du piment T2T | Quatre cellules de flux PromethION ; longueur de lecture N50 allant jusqu'à 107 kb. | N50 moyen = 91,5 kb ; plus longue lecture 2,98 Mb ; assemblage T2T complet |
| Assemblage du génome de sorgho | Séquençage ultra long ONT uniquement (pas d'Illumina/PacBio) | Assemblage complet de bout en bout ; centromères et télomères validés |
Applications clés
Assemblage de génome de novo
Les lectures ultra longues couvrent des éléments répétitifs et des régions riches en GC, comblant les lacunes qui restent non résolues avec le séquençage par lectures courtes ou par séquençage long standard.
Détection de variations structurelles
Le séquençage à long read par nanopore identifie de grandes insertions, des délétions, des inversions et des expansions de répétitions qui influencent la stabilité du génome et le phénotype.
Analyse du génome polyploïde
Le séquençage d'ADN nanopore ultra long améliore le phasage des haplotypes et valide les assemblages dans les plantes polyploïdes et les espèces hybrides.
Assemblage telomère à telomère (T2T)
Des assemblages complets au niveau des chromosomes sont réalisés en couvrant les télomères, les centromères et les régions rDNA avec des lectures uniques.
Transcriptome et séquençage de l'ARN intégration
Combiné avec Séquençage d'ARN direct par nanopore et Séquençage de transcrits complets par nanoporeles chercheurs peuvent lier la structure du génome à l'activité transcriptionnelle.
Flux de travail : Service de bout en bout
CD Genomics propose un flux de travail complet pour séquençage ultra long par nanopore, de la préparation des échantillons à la livraison des données finales. Chaque étape est optimisée pour préserver l'ADN de très haut poids moléculaire et maximiser la longueur de lecture.
1. Préparation de l'échantillon
- Soutien pour les échantillons de plantes, d'animaux et de microbes
- Protocoles spécialisés pour minimiser la dégradation et éliminer les polysaccharides ou les métabolites secondaires.
2. Extraction d'ADN et contrôle de qualité
- Extraction d'ADN à ultra-haut poids moléculaire (uHMW)
- Contrôles de qualité utilisant Qubit, Nanodrop et électrophorèse en champ pulsé
3. Préparation de la bibliothèque
- Kit de séquençage ultra-long par nanopore (SQK-ULK114) avec chimie Kit 14
- Fragmentation basée sur la transposase et ligature rapide des adaptateurs
- Élution nocturne pour préserver de longues molécules d'ADN
4. Séquençage
- Réalisé sur les plateformes PromethION ou GridION
- Atteindre des longueurs de lecture >100 kb N50, avec des lectures maximales dépassant 4 Mb.
5. Analyse bioinformatique
- Appel de base en temps réel et filtrage de qualité
- Assemblage, polissage et détection de variantes
- Support d'assemblage optionnel de télomère à télomère (T2T)
6. Rapport et livraison
- Fichiers FASTQ et BAM avec des métriques de QC
- Rapports d'analyse personnalisés pour l'assemblage du génome ou les études de variants structurels
Analyse bioinformatique
Analyse de base
| Phase d'analyse | Description |
|---|---|
| Basecalling | Convertit les signaux électriques bruts en séquences d'ADN/ARN en utilisant des modèles comme Dorado pour une précision améliorée. |
| Contrôle de la qualité (CQ) | Comprend la distribution de la longueur des lectures, les métriques de couverture et les scores de qualité. |
| Assemblage de novo | Construit des assemblages génomiques à haute contiguïté en utilisant des outils optimisés pour les longues lectures (par exemple, Flye, Canu). |
| Polissage et correction d'erreurs | Affine les profils d'erreurs d'assemblage en utilisant des workflows d'auto-correction à longues lectures ou de polissage hybride. |
Analyse avancée
| Phase d'analyse | Description |
|---|---|
| Appel de variants structurels | Détecte les grands indels, duplications, inversions à l'aide d'outils tels que Sniffles ou CuteSV. |
| Phasage des variants et annotation des SV | Les variantes de phases à travers de longs contigs et annotent les SV pour une interprétation biologique. |
| Soutien Telomère-à-Télomère (T2T) | Complète les assemblages au niveau des chromosomes en fermant les lacunes aux répétitions, aux centromères et aux télomères. |
| Détection des modifications épigénétiques et des bases | Détecte les modifications de l'ADN/ARN (par exemple, 5mC, m6A) en utilisant Remora ou Megalodon lors de l'appel de bases. |
| Classification métagénomique / taxonomique | Classifie les lectures dans des échantillons mixtes en utilisant des flux de travail tels que les pipelines méta EPI2ME. |
Livrables
Les clients recevront :
- Données de séquençage brutes (format FASTQ)
- Rapport de contrôle de qualité (distribution de la longueur de lecture, N50, rendement, précision)
- Résultats d'assemblage génomique et d'analyse des variants optionnels
- Rapport de synthèse du projet
Exigences d'échantillon pour le séquençage ultra-long par nanopore
Pour garantir des résultats de séquençage optimaux, nous exigeons les conditions d'échantillonnage suivantes :
| Type d'échantillon | Type de tissu | Exigence (par cellule) | Remarques |
| Animal | Sang de mammifère | ≥5 mL |
|
| Globules rouges nucléés (Poissons, Reptiles, Amphibiens, Oiseaux/Poules) | ≥100 μL | ||
| Cellules | ≥6×10⁷ |
|
|
| Viscères | ≥0,5 g | Type d'échantillon le moins efficace, difficile d'atteindre N50 > 100 Kb | |
| Muscle | ≥3 g | ||
| Plante | Jeunes Feuilles Tendres | ≥3 g |
2. Rincer à l'eau stérile 3. Sécher et congeler rapidement |
Notre équipe fournit des directives sur la préparation des échantillons pour vous aider à obtenir les meilleurs résultats.
Présentation des résultats de la démo
Distribution de la longueur des lectures
Le graphique ci-joint (d'Oxford Nanopore Technologies) illustre comment séquençage ultra-long prolonge de manière spectaculaire la longueur de lecture par rapport aux méthodes de ligation standard, produisant une queue lisse atteignant plusieurs centaines de kilobases.
Impact du génome du blé
L'incorporation de lectures ONT ultra-longues a augmenté le contig N50 de 341 Ko à 2,15 Mo, conduisant à un assemblage presque sans faille idéal pour la recherche génomique en aval et les programmes de sélection.
Avancement T2T des plantes
Dans les projets récents de génomes de plantes, des protocoles d'extraction et de bibliothèque optimisés ont permis d'obtenir des lectures ultra-longues avec un N50 jusqu'à 440 ko, améliorant considérablement l'automatisation télomère à télomère (T2T) assemblage.
Succès de l'assemblage du sorgho
Un génome complet de sorgho T2T a été assemblé en utilisant uniquement le séquençage ultra-long ONT, démontrant la capacité de la méthode à résoudre des chromosomes entiers sans avoir besoin de technologies complémentaires.
FAQ (Questions Fréquemment Posées)
Q : Quelle longueur de lecture puis-je attendre du séquençage ultra-long par nanopore ?
Vous pouvez vous attendre à des longueurs de lecture N50 généralement comprises entre 50 et plus de 100 kb, et dans des conditions optimales, des lectures individuelles peuvent dépasser 4 Mb—les lectures ultra-longues permettent de résoudre des régions génomiques complexes telles que les répétitions et les centromères.
Q : Pourquoi la longueur de lecture ultra-longue est-elle importante pour l'assemblage de mon génome ?
Les lectures ultra-longues couvrent des régions hautement répétitives ou structurellement complexes, permettant des assemblages sans lacunes ou presque sans lacunes, tels que les génomes T2T, et améliorant la détection des variants structurels que les lectures plus courtes ne peuvent pas résoudre.
Q : Quel impact les longues lectures ont-elles sur la détection des variants structurels ?
Les longues lectures de nanopores améliorent la découverte de grandes insertions, suppressions, inversions et expansions de répétitions en les couvrant directement, ce qui simplifie l'appel de variants et réduit l'ambiguïté.
Q : La séquençage par nanopore peut-il traiter à la fois des échantillons d'ADN et d'ARN ?
Oui, le séquençage par nanopore permet le séquençage direct des molécules d'ADN et d'ARN sans nécessiter d'amplification ni de marquage, ce qui vous permet d'étudier les transcrits et les modifications de bases en parallèle avec la structure du génome.
Q : Quels facteurs affectent la qualité des échantillons pour les lectures ultra-longues ?
La pureté de l'ADN et la longueur des fragments sont critiques. Une extraction de haute qualité avec une dégradation minimale est essentielle, et plusieurs tentatives d'extraction peuvent être nécessaires pour obtenir de l'ADN de poids moléculaire ultra-élevé adapté au séquençage à ultra-longue lecture.
Q : La technologie des nanopores est-elle adaptée aux applications sur le terrain ou portables ?
Oui, parce que les séquenceurs à nanopores peuvent traiter l'ADN ou l'ARN natif en temps réel dans des formats évolutifs - des dispositifs portables MinION aux plateformes à haut débit - cette flexibilité soutient les applications en laboratoire, sur le terrain et à distance.
Étude de cas : Assemblage du génome humain avec des lectures ultra-longues Nanopore
1. Contexte
Le génome humain fait environ 3,1 Gb et contient d'importantes régions répétées, des duplications segmentaires et de l'hétérozygotie, ce qui rend son assemblage difficile avec le séquençage à lecture courte. Les technologies conventionnelles échouent à résoudre les centromères, les télomères et les variants structurels, laissant des lacunes persistantes dans les génomes de référence. Cette étude de cas explore comment séquençage ultra long par nanopore peut surmonter ces barrières.
2. Méthodes
Les chercheurs ont séquencé le Ligne cellulaire humaine GM12878 (Utah/CEPH généalogie) sur le MinION d'Oxford Nanopore plateforme avec chimie 1D R9.4. Des protocoles de préparation de l'ADN ont été conçus pour minimiser la fragmentation et préserver les fragments d'ultra-haut poids moléculaire.
- Données générées : 91,2 Go de séquences (~30× de couverture) provenant de 39 cellules de flux
- Lectures ultra-longues : N50 > 100 kb ; longueur maximale de lecture 882 kb
- Outil d'assemblage : assembleur Canu avec polissage des lectures courtes Illumina pour améliorer la précision.
3. Résultats
- Assemblage uniquement par nanopore NG50 = ~3 Mb
- Ajout de 5× couverture ultra-longue doublée NG50 à 6,4 Mb
- Complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) (4 Mb) résolu dans un seul contig
- 12 grandes lacunes (>50 kb) dans GRCh38 ont été comblées.
- Précision finale après polissage = 99,88 %
- Des lectures ultra-longues ont permis le phasage des haplotypes sur l'ensemble du locus MHC.
Graphique des chromosomes illustrant comment le séquençage ultra long par nanopore a comblé 12 lacunes dans GRCh38, y compris le locus MHC de 16 Mb. Les blocs de couleur continue représentent un assemblage contigu, tandis que les espaces blancs indiquent des régions non résolues.
4. Conclusions
Cette étude démontre que séquençage à lecture ultra longue par nanopore permet des assemblages de génomes humains hautement contigus. La technologie a résolu des loci complexes, comblé des lacunes de référence et fourni un phasage des haplotypes à l'échelle des chromosomes. Ces résultats soulignent son potentiel pour produire des assemblages presque complets de télomère à télomère (T2T) et faire progresser à la fois la génomique fondamentale et les applications translationnelles.
Références:
- Lu D, Liu C, Ji W, Xia R, Li S, Liu Y, Liu N, Liu Y, Deng XW, Li B. Le séquençage ultra-long par nanopore et l'échantillonnage adaptatif stimulent l'assemblage complet du génome de plante de télomère à télomère.. Plante Mol. 2024 Nov 4;17(11):1773-1786. doi: 10.1016/j.molp.2024.10.008. Epub 2024 Oct 16. PMID: 39420560.
- Prall, T.M., Neumann, E.K., Karl, J.A. et al. Séquençage ADN ultra-long cohérent avec pipetage lent automatisé. BMC Genomics 22, 182 (2021).
- Jain M, Koren S, Miga KH, Quick J, Rand AC, Sasani TA, Tyson JR, Beggs AD, Dilthey AT, Fiddes IT, Malla S, Marriott H, Nieto T, O'Grady J, Olsen HE, Pedersen BS, Rhie A, Richardson H, Quinlan AR, Snutch TP, Tee L, Paten B, Phillippy AM, Simpson JT, Loman NJ, Loose M. Séquençage et assemblage du génome humain avec des lectures ultra-longues par nanopore. Nat Biotechnol. avril 2018;36(4):338-345. doi: 10.1038/nbt.4060. Publié en ligne le 29 janvier 2018. PMID: 29431738; PMCID: PMC5889714.
