Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que l'amplification de sondes dépendante de la ligature multiplex (MLPA) ?
L'amplification par sondes dépendantes de la ligature multiplex (MLPA) est une technique de biologie moléculaire largement utilisée pour détecter le nombre de copies de diverses séquences d'ADN dans la recherche sur les maladies génétiques humaines. Cette technique implique la ligature d'oligonucléotides de sondes suivie d'une amplification par PCR, permettant l'analyse de jusqu'à 50 paires de sondes multiplex conçues pour s'hybrider avec des loci cibles spécifiques.
Chaque paire de sondes est conçue pour générer des produits d'amplification d'une longueur spécifique. En incorporant des séquences universelles à leurs extrémités, toutes les sondes ligaturées peuvent être amplifiées dans une seule réaction PCR à l'aide d'une paire de primers. Le primer PCR direct est marqué avec une étiquette fluorescente 6-FAM™ d'Applied Biosystems™, permettant la détection et la quantification en fonction des tailles moléculaires des sondes, telles que déterminées par électrophorèse capillaire automatisée (CE).
Amplification par Probes Dépendantes de Ligation Multiplex (MLPA) visualisée en trois étapes : 1) Dénaturation et Hybridation, 2) Ligation, 3) Amplification avec des amorces PCR fluorescentes pour détecter les variations du nombre de copies.
Cette méthode a été utilisée avec succès dans l'étude des maladies causées par des délétions et des duplications d'exons, telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et les mutations des gènes BRCA1/BRCA2. De plus, les avancées de la technique MLPA permettent désormais son application dans l'analyse quantitative de la méthylation de diverses séquences génomiques.
Pourquoi choisir MLPA ?
La MLPA est préférée pour son analyse précise et à haut débit, même avec des échantillons d'ADN limités. Contrairement à la PCR traditionnelle, la MLPA peut tester plusieurs loci génétiques à la fois, ce qui en fait une solution rentable et fiable pour détecter les anomalies génétiques. Elle est également plus sensible que d'autres méthodes de PCR multiplex, offrant une meilleure détection des variations du nombre de copies (VNC).
La MLPA combine l'hybridation de sondes d'ADN avec la technologie PCR, offrant les avantages suivants :
- Haute EfficacitéUne seule réaction peut détecter des variations du nombre de copies dans jusqu'à 50 séquences cibles.
- Délai d'exécution rapideDes expériences complètes peuvent être réalisées en 24 heures.
- Simplicité opérationnelleDifférents kits de réactifs suivent des procédures presque identiques, rendant la technique facile à apprendre et à maîtriser.
Comparaison technique : MLPA et méthodes alternatives d'analyse génétique
| Paramètre | MLPA | qPCR | ddPCR | Séquençage Sanger | NGS ciblé | WES | WGS | Microarray CGH |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Niveau de multiplexage | Jusqu'à 50 cibles | Peu | Peu | N/A | Dizaines–Centaines | Des milliers | Génome entier | À l'échelle du génome |
| But principal | Détection de CNV | Quantification | Quantification | Validation des variantes de séquence | Détection de variants (panneau) | Variants d'exon | Toutes les variantes et SV | CNV à l'échelle du génome |
| Sensibilité pour CNV | Élevé | Modéré | Très élevé | Bas | Élevé | Moyen | Élevé | Élevé |
| Détection de mutations ponctuelles | Non | Rare | Limité | Oui | Oui | Oui | Oui | Non |
| Équipement nécessaire | PCR + CE | machine de qPCR | instrument ddPCR | Séquenceur de Sanger | instrument NGS | NGS | NGS | Scanner de microarray |
| Débit | Moyen | Bas | Bas | Bas | Moyen | Moyen | Élevé | Élevé |
| Précision Quantitative | Bon | Variable | Excellent | n/a | Bon | Bon | Bon | Bon |
| Délai de traitement | ~1 jour | ~1 jour | ~1 jour | ~1 semaine | ~1 à 2 semaines | ~2 à 4 semaines | ~3 à 6 semaines | ~2 à 3 semaines |
| Coût | Bas | Bas | Moyen | Moyen | Moyen | Élevé | Le plus élevé | Élevé |
Applications de la MLPA
La MLPA est une méthode fiable pour détecter les variations génétiques avec une grande sensibilité, et elle trouve son application dans divers domaines de recherche et cliniques. Elle permet aux chercheurs d'analyser les variations structurelles dans le génome, fournissant des informations sur les troubles génétiques et les mécanismes de la maladie. Cette technologie polyvalente soutient un large éventail d'enquêtes scientifiques, y compris, mais sans s'y limiter :
- Détection de réarrangements génétiques à petite échelle
Les gènes validés incluent BRCA1, BRCA2, MSH2, MLH1, DMD, APC, SMA, NF1, NF2, VHL, TSC1/2, etc.
- Détection de réarrangements génomiques à grande échelle:
Les troubles validés incluent le syndrome de Williams, le syndrome de Prader-Willi/Angelman, le syndrome de DiGeorge, le syndrome du Cri du Chat, la maladie de Pelizaeus-Merzbacher, la CMT1A et la HNPP.
- Variations du nombre de copies sub-télomériques
- Test de l'aneuploïdie chromosomique
- Recherche sur le diagnostic des tumeurs:
Analyse du nombre de copies d'ADN dans des malignités telles que la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), la leucémie lymphocytaire chronique (LLC), les oligodendrogliomes, les mélanomes et les neuroblastomes.
- Analyse quantitative de la méthylation:
Les applications incluent le syndrome de Prader-Willi/Angelman, le syndrome de Beckwith-Wiedemann, MGMT, MLH1, le syndrome de l'X fragile et l'inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs.
- Analyse de l'expression de l'ARNm:
Se concentrer sur les gènes impliqués dans l'apoptose et la réponse inflammatoire.
Flux de travail du service d'analyse par amplification de sondes dépendante de la ligature multiplexe
Chez CD Genomics, nous proposons un service MLPA simplifié et complet pour garantir des résultats cohérents et de haute qualité. Notre flux de travail standardisé est conçu pour soutenir la reproductibilité et accélérer la découverte dans les études génomiques.
1. Soumission d'échantillon
Soumettez vos échantillons d'ADN, y compris des tissus, du sang ou des lignées cellulaires. Notre équipe s'assure qu'ils répondent aux normes de qualité pour l'analyse.
2. Extraction d'ADN et contrôle de qualité
Si nécessaire, nous proposons des services d'extraction d'ADN et effectuons des contrôles de qualité pour garantir une qualité d'ADN optimale pour le MLPA.
3. Hybridation et ligation de sondes
Les sondes sont hybridées à votre ADN et ligaturées aux régions cibles pour l'analyse des CNV.
4. Amplification par PCR
Plusieurs régions d'ADN sont amplifiées simultanément à l'aide de primers fluorescents, permettant une détection efficace des CNV.
5. Électrophorèse capillaire
Les produits amplifiés sont analysés par électrophorèse capillaire pour une quantification précise des CNV.
6. Analyse des données et reporting
Nous fournissons des rapports statistiques et d'annotation détaillés, accompagnés de résultats graphiques pour une interprétation facile.
Exigences d'échantillon pour MLPA
| Paramètre | Exigences |
|---|---|
| Tissu | Tissu frais congelé ≥ 100 mg, FFPE ≥ 4 lames, 5~20 µm |
| Échantillon de sang | ≥ 2~4 mL de sang dans un tube EDTA |
| Ligne cellulaire | ≥ 1 x 10^6 cellules |
| ADN | ≥ 500 ng, OD260/280 aussi proche que possible de 1,8 à 2,0 |
Conseils:
- Expédiez des échantillons sur de la glace bleue ou de la glace sèche pour préserver leur intégrité.
- Services d'extraction d'ADN disponibles sur demande.
- Pour des types d'échantillons spéciaux ou des scénarios à faible entrée, contactez-nous pour un plan personnalisé.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le service MLPA ?
CD Genomics propose un service MLPA complet avec un support expert, des résultats rapides et des données fiables. Notre équipe garantit des tests de haute qualité en utilisant la dernière technologie, avec des délais d'exécution rapides et un support mondial. Nous suivons un contrôle qualité strict pour fournir des résultats précis et fiables pour vos besoins de recherche.
- Équipe d'experts : Notre équipe de généticiens et de biologistes moléculaires garantit des résultats de haute qualité à chaque test.
- Technologie de pointe : Nous utilisons les dernières plateformes MLPA pour garantir des données précises et fiables.
- Délai d'exécution rapide : Recevez votre rapport MLPA complet en temps voulu, garantissant que votre recherche ou votre prise de décision clinique ne soit pas retardée.
- Portée mondiale : Service aux clients à travers le monde avec un support client dans plusieurs fuseaux horaires.
- Assurance qualité : Nous suivons des protocoles de contrôle qualité rigoureux, garantissant que nos tests respectent les normes les plus élevées en matière de précision et de fiabilité.
Références :
- de Boer, S., White, S.J. Génotypage de variations du nombre de copies multialléliques par amplification par ligation dépendante de sondes multiples (MLPA). Dans : Génotypage. Springer, New York, NY, 147–153 (2017). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6442-0_9
- Cuevas, D., Velasco, A. et al. Hétérogénéité intratumorale dans le carcinome séreux de l'endomètre évaluée par séquençage ciblé et amplification par ligation dépendante de sondes multiples (MLPA) : une étude descriptive. Histopathologie 75, 724–733 (2019). DOI : 10.1111/his.14001
- Fu, X., Shi, Y., Ma, J. et al. Avancées de la technologie d'amplification par ligation dépendante de sondes multiplexes dans le diagnostic moléculaire. BioTechniques 73, 205–213 (2022). DOI : 10.2144/btn-2022-0017
Résultats de la démo
Questions Fréquemment Posées
1. Quels types d'échantillons peuvent être utilisés pour la MLPA ?
Vous pouvez utiliser de l'ADN génomique extrait de diverses sources telles que le sang, la salive ou des échantillons de tissu.
2. La MLPA peut-elle détecter des mutations ponctuelles ?
MLPA est principalement utilisé pour détecter les variations du nombre de copies (délétions, duplications), mais il peut être adapté pour la détection de mutations dans des cas spécifiques.
3. Quel est le coût du test MLPA ?
Le coût des tests MLPA varie en fonction du nombre de cibles analysées. Veuillez nous contacter pour un devis.
Étude de cas : Utilisation combinée de la MLPA et du séquençage de l'exome entier (WES) dans un trouble neuromusculaire rare
Référence
Xia Y., Feng Y., Xu L., Chen X., Gao F., Mao S. (2021). Rapport de cas : Le séquençage de l'exome entier avec MLPA a révélé des variants dans deux gènes chez un patient présentant des manifestations combinées d'atrophie musculaire spinale et de dystrophie musculaire de Duchenne.. Frontiers en Génétique, Volume 12, Article 605611. DOI:10.3389/fgene.2021.605611.
1. Contexte
Ce cas concerne un patient masculin de 11 mois présentant un développement moteur insuffisant et une faiblesse musculaire progressive. Les caractéristiques cliniques ressemblaient à la fois à Atrophie musculaire spinale (AMS) et Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), qui sont des troubles génétiques neuromusculaires distincts. Un diagnostic génétique précis était crucial compte tenu des symptômes qui se chevauchent et des implications pour le traitement.
2. Méthodes
Pour identifier la ou les causes génétiques, les cliniciens ont utilisé un approche de test génétique à deux niveaux:
- Séquençage de l'exome complet (WES) pour dépister les variants de séquence dans toutes les régions codantes.
- Amplification de Probes Dépendante de Ligation Multiplex (MLPA) pour détecter spécifiquement variations du nombre de copies (VNC) comme des suppressions dans les gènes cibles.
La MLPA est une méthode bien établie pour la détection des CNV au niveau des exons, ce qui la rend adaptée aux loci DMD et SMA.
3. Résultats
L'analyse combinée a identifié :
- A déletion homozygote des exons 7 et 8 dans le SMN1 gène, conforme à la SMA.
- Un suppression dans l'exon 50 de le DMD gènediagnostic de la DMD.
Ces résultats ont été confirmés par MLPA suite aux prédictions de WES.
Les rapports de tests génétiques MLPA montrant zéro copie des exons 7 et 8 de SMN1 et une délétion homozygote de l'exon 50 de DMD dans l'échantillon du patient, par rapport aux contrôles de référence.
4. Conclusions
L'intégration de MLPA et WES ont amélioré la précision diagnostique. dans ce cas complexe impliquant des troubles neuromusculaires doubles. Cette approche souligne l'importance de combiner la détection de variants larges (WES) avec le profilage ciblé des CNV (MLPA) pour un diagnostic génétique complet dans des phénotypes cliniquement chevauchants.
