Analyse de l'instabilité des microsatellites

Qu'est-ce que l'instabilité des microsatellites ?

L'instabilité des microsatellites (MSI) est un phénomène caractérisé par des modifications de la longueur des microsatellites, qui sont des séquences d'ADN répétitives dispersées dans tout le génome. Ces microsatellites, également appelés répétitions de séquences simples (SSR) ou répétitions en tandem courtes (STR), consistent généralement en unités répétées de 1 à 6 nucléotides. Chez les humains, les microsatellites résident principalement dans des régions non codantes, bien qu'ils puissent également être présents dans des régions codantes.

Lors de la réplication de l'ADN, les microsatellites sont particulièrement sensibles aux événements de glissement, au cours desquels l'ADN polymérase peut insérer ou supprimer des unités de répétition de nucléotides, entraînant des modifications de leur longueur. Normalement, ces altérations sont corrigées par le système de réparation des mésappariements (MMR). Cependant, lorsque des composants du système MMR sont défectueux, en raison de mutations ou de modifications épigénétiques, une instabilité des microsatellites se produit.

Qu'est-ce qu'un test d'instabilité des microsatellites ?

Un test MSI est une procédure diagnostique conçue pour identifier la présence de MSI dans un échantillon d'ADN. Ce test est essentiel pour élucider les bases génétiques de certains cancers et pour adapter des stratégies thérapeutiques appropriées. Les tests MSI détectent généralement des écarts dans la longueur des répétitions de microsatellites, ce qui peut signifier des défauts dans le système MMR.

Différentes méthodologies sont utilisées pour les tests de MSI, chacune ayant des applications et des sensibilités distinctes. Ces tests sont particulièrement cruciaux dans le diagnostic du cancer, notamment pour les cancers colorectaux et le syndrome de Lynch, où des niveaux élevés de MSI peuvent indiquer une prédisposition génétique au cancer.

Méthodes du test d'instabilité des microsatellites

• PCR avec électrophorèse capillaire

La norme conventionnelle pour le test MSI combine la réaction de polymérase en chaîne (PCR) avec l'électrophorèse capillaire. Cette approche commence par l'amplification des régions de microsatellites à l'aide de primers marqués par fluorescence. Par la suite, les produits amplifiés sont séparés par taille grâce à l'électrophorèse capillaire, ce qui permet la détection et l'analyse des variations dans les longueurs de répétition.

Le processus commence par l'extraction de l'ADN à partir d'échantillons de tissus tumoraux et normaux. Des loci microsatellites spécifiques sont ensuite amplifiés par PCR, avec un des amorces marqué par un colorant fluorescent. Les produits de PCR sont soumis à une électrophorèse capillaire, qui les sépare en fonction de leur taille et permet la détection de l'instabilité des microsatellites (MSI) en analysant les différences de longueurs de répétition. Cette méthode est très appréciée pour sa spécificité et sa fiabilité dans la détection de la MSI, maintenant son statut de référence.

• PCR avec analyse de courbe de fusion à haute résolution

Une autre méthode pour le test MSI implique la PCR couplée à l'analyse de courbe de fusion à haute résolution (HRM). Cette technique utilise des colorants intercalants de l'ADN pour surveiller les changements de la température de fusion (Tm) des fragments d'ADN, ce qui fournit des informations sur la stabilité des microsatellites.

La procédure consiste à amplifier des fragments d'ADN en présence d'un colorant à haute résolution. Après amplification, l'ADN est progressivement chauffé tout en surveillant le signal de fluorescence pour détecter les différences de températures de fusion. L'analyse HRM est particulièrement sensible aux variations de longueur mineures et est efficace pour identifier les MSI, y compris les changements d'une seule base et les petites insertions ou délétions.

• Séquençage de nouvelle génération (NGS)

Séquençage de nouvelle génération (NGS) les technologies offrent une méthode à haut débit pour détecter l'instabilité des microsatellites (MSI) en séquençant plusieurs loci de microsatellites à travers le génome. Cette approche peut être appliquée par séquençage du génome entier (SGE), séquençage de l'exome entier (WES)ou séquençage de région ciblée (SRC) pour identifier les variations MSI et autres variations génétiques.

Le processus consiste à utiliser des technologies de séquençage à haut débit pour séquencer des régions de microsatellites. Les données de séquençage sont ensuite analysées pour détecter des variations dans les longueurs de répétition des microsatellites et identifier l'instabilité des microsatellites (MSI). Le séquençage de nouvelle génération (NGS) offre une vue d'ensemble de l'instabilité des microsatellites ainsi que d'autres mutations génétiques, fournissant un profil génétique approfondi de la tumeur.

Introduction du service d'analyse de l'instabilité des microsatellites

CD Genomics utilise le kit Promega, qui est une méthode basée sur la PCR multiplex fluorescente et l'électrophorèse capillaire pour détecter le statut MSI. En général, le système d'analyse MSI comprend la comparaison des profils alléliques de marqueurs microsatellites, impliquant cinq marqueurs de répétition mononucléotidique presque monomorphiques (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21 et NR-24) et deux marqueurs de répétition pentanucléotidique hautement polymorphes (Penta C et Penta D), qui servent de contrôle de qualité pour l'authentification des échantillons normaux et tumoraux appariés. Pour la détection de MSI, les tissus tumoraux et normaux de chaque patient doivent être analysés en parallèle. En général, une détection de MSI dans ≥ 30-40 % des marqueurs est considérée comme MSI-élevé (MSI-H), tandis qu'une détection dans < 30-40 % des marqueurs est considérée comme MSI-faible (MSI-L), ou MSS si aucun marqueur n'est instable.

Avantages et applications de l'analyse de l'instabilité des microsatellites

• Précision supérieure à l'IHC, rentable et délai d'exécution plus rapide que le NGS.
• Dépistage du syndrome de Lynch
• Détection du pronostic dans le cancer colorectal sporadique
• Tests diagnostiques dans une large gamme de tumeurs solides

Flux de travail d'analyse de l'instabilité des microsatellites

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon 1) Pour le tissu normal 5 mL de sang périphérique dans un tube EDTA 5-6 lames de tissu FFPE ou bloc contenant uniquement du tissu non tumoral Nous pouvons tenter d'isoler le tissu non tumoral à partir de l'échantillon tumoral soumis dans les cas où aucun tissu alternatif n'est disponible. 2) Pour le tissu tumoral Tissu FFPE (le bloc de paraffine est préféré). RemarqueUn échantillon de tissu normal supplémentaire, non tumoral, provenant du même individu source est nécessaire pour les tests de comparaison dans l'analyse MSI. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de test Utilisation de l'analyseur génétique Applied Biosystems® 3500 xL.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Analyse de courbe de fusion à haute résolution Acquisition de données Analyse des longueurs de répétition Identification de l'IMR Contrôle de qualité Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Données brutes
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans l'analyse de l'instabilité des microsatellites pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose un service avancé d'analyse de l'instabilité des microsatellites en utilisant des technologies de pointe telles que la PCR, la HRM et le NGS. Ce service est conçu pour répondre aux besoins des chercheurs cherchant des informations détaillées sur l'instabilité des microsatellites dans divers types de cancer. En employant des méthodologies de pointe et des technologies à haut débit, CD Genomics garantit une détection précise et fiable de l'IM.

Références :

1. Le, D.T. et al.. (2017) La déficience en réparation des mésappariements prédit la réponse des tumeurs solides au blocage de PD-1. Science 10.1126/scienc.aan6733.
2. Le, D.T. et al.. (2015) Blocage de PD-1 dans les tumeurs avec déficience de réparation des mésappariements. Nouv. Engl. J. Med. 372, 2509–20.
3. Directives de pratique clinique NCCN en oncologie : Évaluation génétique/familiale à haut risque : colorectal. Version 2.2015.
4. Manuel technique Promega. Système d'analyse MSI v1.2. Oct 2012.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

1. Quelle est l'importance de l'IMS dans le diagnostic du cancer ?

L’instabilité des microsatellites (MSI) constitue un marqueur crucial indiquant des systèmes de réparation des mésappariements défectueux et est étroitement associée à divers cancers, en particulier ceux liés au syndrome de Lynch. La détection de la MSI fournit des informations essentielles sur plusieurs dimensions, y compris le diagnostic, le pronostic et la planification du traitement. En identifiant la MSI, les cliniciens peuvent mieux caractériser les bases génétiques du cancer, ce qui conduit à des décisions médicales plus précises et éclairées.

2. Comment le séquençage de nouvelle génération (NGS) améliore-t-il les tests de MSI ?

NGS fait progresser de manière significative le test MSI en permettant une analyse complète et à haut débit de plusieurs loci de microsatellites. Cette technologie offre des informations détaillées sur à la fois l'MSI et d'autres variations génétiques, améliorant ainsi la précision et la profondeur de l'analyse génétique. La capacité du NGS à évaluer simultanément de nombreux loci permet une compréhension plus holistique du génome, conduisant à une précision diagnostique améliorée et à la possibilité de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.

3. Des tests MSI peuvent-ils être effectués sur des échantillons non tumoraux ?

Les tests MSI ne se limitent pas aux échantillons de tissu tumoral ; ils peuvent également être réalisés sur divers autres types d'échantillons, y compris des échantillons de sang grâce à l'analyse de l'ADN tumoral circulant (ctDNA). Bien que les échantillons de tissu tumoral soient généralement préférés pour leur précision, la possibilité d'utiliser des échantillons non invasifs élargit la praticité des tests MSI dans les contextes cliniques, en particulier pour le suivi de la progression de la maladie et de la réponse au traitement.

4. Quels sont les avantages d'utiliser le service d'analyse MSI de CD Genomics ?

CD Genomics propose un service de test MSI avancé et à haute sensibilité qui tire parti des dernières technologies génomiques. L'entreprise fournit des solutions sur mesure conçues pour répondre aux besoins spécifiques des applications de recherche et cliniques. Un soutien expert garantit la livraison de résultats de haute qualité et de données complètes, faisant de CD Genomics un partenaire fiable pour une analyse MSI sophistiquée. Leur engagement envers des méthodologies à la pointe de la technologie assure que les clients reçoivent les informations les plus précises et exploitables pour leurs projets.

L'amplification isotherme à basse température des microsatellites réduit considérablement la formation d'artefacts de répétition et améliore la détection de l'instabilité des microsatellites dans le cancer.

Journal : Recherche sur les acides nucléiques

Facteur d'impact : 16,6

Publié : 17 septembre 2019

Contexte

Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétitives utilisées dans la recherche génétique et le diagnostic du cancer. L'instabilité des microsatellites (MSI), une altération dans le cancer due à des défauts de réparation de l'ADN, est généralement détectée par PCR et électrophorèse capillaire. Les auteurs ont introduit l'amplification isotherme à basse température avec amplification par polymérase recombinante (RPA) comme une alternative prometteuse, réduisant les artefacts de PCR et améliorant la détection de MSI et l'appel des allèles.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans l'évaluation des essais de microsatellites LT-RPA à répétition de mono- à tétra-nucléotides sur des échantillons de sang, le LT-RPA a montré une amélioration significative par rapport à la PCR en simplifiant les profils de microsatellites grâce à la réduction ou à l'élimination des pics de stutter, rendant ainsi l'identification des allèles plus claire et plus précise. Cela était particulièrement évident pour des microsatellites difficiles comme BAT26, D18S61 et D12ATA63, où la PCR entraînait souvent des pics de stutter et des biais d'amplification qui compliquaient l'appel des génotypes. Le séquençage des amplicons a en outre confirmé que les profils LT-RPA étaient cohérents avec les résultats de la PCR, à l'exception d'un polymorphisme spécifique, et a permis une identification précise des allèles.

Lors de l'évaluation des microsatellites à répétition de tri-nucléotides impliqués dans des maladies génétiques, la LT-RPA a efficacement amplifié les répétitions CTG et GAA avec des pics de stutter réduits par rapport à la PCR, bien qu'elle ait rencontré des difficultés avec les microsatellites FMR1 riches en CG. Pour les répétitions CAG de HTT, la LT-RPA a fourni de meilleurs résultats avec des conditions de réaction optimisées, démontrant sa capacité à gérer des structures de répétition complexes.

Figure 1. Profils de microsatellites de BAT26, D18S61 et D12ATA63 obtenus avec quatre échantillons de sang (nommés B1, B2, B3 et B4) provenant d'individus en bonne santé, utilisant la PCR (20 ng d'ADN dans 20 μl) et la LT-RPA.

Lors des tests de HT17 LT-RPA sur des dilutions en série de lignées cellulaires cancéreuses, LT-RPA a amélioré la limite de détection (LOD) pour l'instabilité des microsatellites (MSI), en particulier pour les petites délétions, en minimisant les pics de stutter qui entravaient la détection en PCR. LT-RPA a également facilité une meilleure identification des allèles mutants dans des échantillons mixtes, en s'attaquant aux problèmes de pics de stutter présents dans la PCR.

Figure 2. HT17 LT-RPA améliore la limite de détection de l'MSI par rapport à la PCR.

Enfin, le LT-RPA s'est avéré très efficace pour détecter l'MSI dans des échantillons de CRC, y compris ceux où la PCR a échoué en raison de pics de stutter. La méthode a offert une meilleure clarté et précision, et la validation avec la PCR à petit pool a confirmé les résultats du LT-RPA et détecté des allèles mutés supplémentaires, bien que certaines découvertes puissent être des artefacts de la PCR.

Figure 3. Détection de l'instabilité des microsatellites (MSI) dans 12 échantillons de CRC MMR-déficiens congelés frais (S1-S12) en utilisant les microsatellites HT17 et LT-RPA ainsi que la PCR.

Conclusion

Les auteurs ont développé une méthode RPA à basse température pour les microsatellites qui réduit les artefacts de stutter et simplifie l'appel des allèles. Cette méthode améliore la détection de l'instabilité des microsatellites (MSI) dans le cancer colorectal et montre un fort potentiel en tant qu'alternative à la PCR pour une utilisation clinique et de recherche.

Référence :

1. Daunay A, Duval A, Baudrin LG, et al. L'amplification isotherme à basse température des microsatellites réduit considérablement la formation d'artefacts de répétition et améliore la détection de l'instabilité des microsatellites dans le cancer. Recherche sur les acides nucléiques2019, 47(21):e141-.