Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que le CLIP-seq ?
Les scientifiques veulent souvent savoir comment les protéines interagissent avec l'ARN à l'intérieur des cellules. Ces interactions sont importantes car elles aident à contrôler le fonctionnement des gènes et le comportement des cellules. CLIP-seq, qui signifie "Crosslinking et Immunoprécipitation suivis de Séquençage," est une méthode qui aide les chercheurs à déterminer précisément où les protéines se lient à l'ARN.
Dans le CLIP-seq, les chercheurs exposent les cellules à une lumière ultraviolette (UV). Cela fait coller les protéines et l'ARN là où elles se touchent. Ensuite, ils utilisent des anticorps spéciaux pour extraire ces paires protéine-ARN du reste de la cellule. Après cela, ils fragmentent l'ARN en petits morceaux et le transforment en ADN. Enfin, ils séquencent cet ADN pour savoir où les protéines étaient liées à l'ARN.
Comparé à une méthode plus simple appelée RIP-seq La séquençage d'immunoprécipitation d'ARN (RNA Immunoprecipitation sequencing), le CLIP-seq présente deux grands avantages :
- Une spécificité plus élevée : La lumière UV garantit que seules les protéines en contact direct avec l'ARN sont liées, ce qui réduit les faux positifs.
- Meilleure résolution : le CLIP-seq montre exactement quelle partie de l'ARN la protéine se liait, parfois jusqu'à quelques nucléotides.
Packages de technologies CLIP-seq
CLIP-seq classique (HITS-CLIP)
CLIP-seq classique, parfois appelé HITS-CLIP, utilise la lumière UV pour relier directement les protéines et l'ARN à l'intérieur des cellules. Les scientifiques utilisent ensuite des anticorps pour extraire ces paires protéine-ARN. Ensuite, l'ARN est converti en ADN et séquencé. Cette méthode fournit un carte large à l'échelle du génome où les protéines se lient à l'ARN.
iCLIP-seq (CLIP à résolution de nucléotides individuels)
iCLIP-seq est conçu pour cartographier les interactions protéine-ARN avec précision au niveau des nucléotides simplesLors de l'étape de transcription inverse, l'iCLIP capture les endroits où l'enzyme se bloque en raison des protéines liées, créant des points de "coupure" précis.
Cette technologie est particulièrement utile pour étudier :
- Régulation de l'épissage
- Maturation de l'ARN
- Fonction de l'ARN non codant
iCLIP-seq aide les chercheurs à identifier positions exactes de liaison des protéines sur l'ARN, ce qui le rend idéal pour des études à haute résolution.
miCLIP-seq (CLIP à Résolution de Méthylation à Nucleotide Individuel)
miCLIP-seq est une version spécialisée de iCLIP utilisée pour étudier Modifications de l'ARN, en particulier méthylation m6A.
En combinant le recroisement UV avec des anticorps spécifiques contre les bases méthylées, le miCLIP-seq permet aux chercheurs de détecter :
- Sites de méthylation à résolution d'un seul nucléotide
- Sites de liaison des protéines "lectrices" qui reconnaissent les modifications de l'ARN
Cette technique est cruciale pour la compréhension. régulation épitranscriptomique et comment les modifications chimiques de l'ARN affectent l'expression des gènes et la fonction cellulaire.
eCLIP-seq (CLIP-seq amélioré)
eCLIP-seq améliore les méthodes CLIP traditionnelles en ajoutant contrôles d'entrée de taille correspondante pour mieux distinguer les véritables événements de liaison du bruit de fond.
Les avantages de l'eCLIP-seq incluent :
- Rapport signal/bruit plus élevé
- Amélioration de la reproductibilité
- Une plus grande confiance dans l'identification des véritables interactions protéine-ARN.
eCLIP-seq est devenu une méthode populaire pour des projets à grande échelle, tels qu'ENCODE, où des données précises et reproductibles sont essentielles.
PAR-CLIP-seq
PAR-CLIP-seq implique l'alimentation des cellules avec des molécules appelées analogues de ribonucléosides photoréactifs, comme la 4-thiouridine (4SU). Celles-ci sont incorporées dans l'ARN nouvellement transcrit. Lorsque la lumière UV frappe les cellules, elle favorise liaison croisée plus forte entre l'ARN et les protéines liées.
Une caractéristique unique de PAR-CLIP est sa capacité à identifier sites de liaison exacts au niveau des nucléotides, souvent détecté par des caractéristiques Conversions T-à-C dans les données de séquence.
Comparaison de l'ATAC-seq, du ChIP-seq, du CUT&Tag, du RIP-seq et du CLIP-seq
Les chercheurs se demandent souvent quelle technologie de séquençage convient le mieux à leur étude. CD Genomics propose toutes ces méthodes pour vous aider à explorer la régulation des gènes sous différents angles. Le tableau ci-dessous facilite la comparaison de ces outils puissants :
| Technologie | Objectif principal | Molécule cible | Résolution | Fonctionnalités spéciales |
|---|---|---|---|---|
| ATAC-seq | Trouve des régions ouvertes de l'ADN. | ADN | Élevé | Méthode rapide pour observer l'accessibilité de la chromatine |
| ChIP-seq | Cartographie de la liaison des protéines sur l'ADN | ADN | Élevé | Idéal pour étudier les facteurs de transcription et les modifications des histones. |
| CUT&Tag | Cartographie des interactions protéine-ADN avec moins de bruit de fond. | ADN | Très élevé | Exigences d'entrée inférieures à celles du ChIP-seq |
| RIP-seq | Étudie les interactions protéine-ARN | ARN | Moyen | Protocole plus facile mais résolution inférieure à celle du CLIP-seq. |
| CLIP-seq | Identifie les sites de liaison précis des protéines sur l'ARN. | ARN | Très élevé | Le réticulage par UV garantit une haute spécificité et une résolution au niveau des nucléotides. |
Chaque méthode offre des perspectives uniques. Vous pouvez choisir une seule technique ou en combiner plusieurs pour une analyse plus approfondie.
"Chez CD Genomics, nous nous engageons à rester en avance grâce à une innovation constante. Nous avons acquis une expertise approfondie en épigénomique, en nous concentrant non seulement sur des technologies de base telles que l'analyse de méthylation, l'ATAC-seq, le ChIP-seq et le RIP-seq, mais aussi en adoptant des méthodes de pointe telles que le CLIP-seq et le CUT&Tag. Notre objectif est d'aider nos clients à résoudre même les défis les plus complexes dans la recherche épigénétique."
Flux de travail expérimental CLIP-seq
Bioinformatique CLIP-seq
Traitement des données de base
Une fois que nous recevons les données de séquençage, nous commençons par les nettoyer. Cela implique :
- Contrôle de qualité : Vérification des erreurs ou des lectures de faible qualité qui pourraient causer des problèmes par la suite.
- Rognage des adaptateurs : Suppression des morceaux restants d'ADN utilisés lors de la préparation de la bibliothèque.
- Cartographie des lectures : aligner chaque fragment d'ARN au bon endroit sur le génome.
Analyse avancée et interprétation fonctionnelle
- Appel de pic : Identification des régions où de nombreux fragments d'ARN s'accumulent, signalant un site de liaison protéique.
- Découverte de motifs : Recherche de courtes séquences d'ARN que les protéines préfèrent lier.
- Analyse positionnelle : Examen des emplacements des sites de liaison, comme près du début ou de la fin des gènes (TSS, TTS, codons de départ/arrêt).
- Analyse des voies GO et KEGG : Lien entre les gènes liés et les fonctions biologiques et voies connues.
- Analyse différentielle : Comparer des échantillons pour voir comment la liaison change dans différentes conditions.
- Analyse CIMS : Détection de minuscules changements dans l'ARN causés par le processus de réticulation, aidant à identifier les sites de liaison.
Nous créons également graphes et visualisations clairs pour aider les chercheurs à voir et interpréter leurs résultats.
Intégration Multi-Omique
La recherche moderne implique souvent plusieurs types de donnéesCD Genomics aide les chercheurs à combiner le CLIP-seq avec :
- ChIP-seq : Étude des interactions protéine-ADN.
- ATAC-seq : Trouver des régions ouvertes de l'ADN.
- RNA-seq : Mesurer les niveaux d'expression génique.
Avantages de nos services CLIP-seq
Expérience approfondie dans diverses espèces et types d'échantillons
Notre équipe a géré des projets de CLIP-seq pour une grande variété d'organismes, y compris :
- Humains
- Souris, rats et autres animaux
- Des plantes telles que le riz, le blé et la tomate.
- Des micro-organismes comme les bactéries et les champignons
Taux de réussite élevés
Les expériences CLIP-seq peuvent être complexes. Mais chez CD Genomics, notre les taux de réussite dépassent 95 %grâce à :
- Protocoles de laboratoire optimisés
- Conception expérimentale rigoureuse
- Contrôle qualité rigoureux
Algorithmes de détection de pics propriétaires
Nous avons développé nos propres algorithmes pour appel de pointe, l'étape cruciale d'identification des sites de liaison des protéines à l'ARN. Nos méthodes propriétaires :
- Réduire le bruit de fond
- Améliorer la détection des véritables événements de liaison
- Fournir des résultats plus clairs et plus fiables
Analyses multi-omiques personnalisées
Chaque question de recherche est différente. C'est pourquoi nous proposons analyse de données personnalisée et l'intégration multi-omiques, vous permettant de :
- Connectez les données CLIP-seq avec les résultats ChIP-seq, ATAC-seq ou RNA-seq.
- Explorer des réseaux réglementaires complexes
- Acquérir une compréhension approfondie de l'expression et de la régulation des gènes.
Validation stricte de la qualité des anticorps
Les anticorps sont les outils clés dans le CLIP-seq. Nous :
- Tester chaque anticorps pour sa spécificité et son efficacité.
- Fournir des données de validation pour garantir la confiance dans les résultats.
- Aider les clients à choisir les bons réactifs pour leurs cibles.
Délais d'exécution rapides et livrables de haute qualité
Nous savons que le temps est essentiel dans la recherche. CD Genomics propose :
- Délai d'exécution rapide du projet
- Rapports détaillés et prêts à être publiés
- Des fichiers de données propres et bien organisés pour une analyse en aval facile.
Dossier de publication solide
Nos scientifiques ont contribué à des études publiées dans revues de premier plan aimer Nature, Celluleet Cellule MoléculaireNous appliquons le même niveau de rigueur scientifique à chaque projet client.
Applications de CLIP-seq
Comprendre les protéines liant l'ARN (RBP)
- Comment les gènes sont activés ou désactivés
- Comment les cellules réagissent au stress
- Comment différents types de cellules développent des identités uniques
Étudier le splicing alternatif
- Découvrez de nouvelles variantes d'ARN
- Comprendre comment les erreurs d'épissage contribuent aux maladies.
- Identifier de nouvelles cibles pour le développement de médicaments.
Exploration des ARN non codants (ncARN)
- Découvrez comment les RBP interagissent avec les ARN non codants.
- Révélez de nouvelles fonctions pour ces molécules mystérieuses.
- Identifier des biomarqueurs potentiels pour des applications de recherche
Identification des cibles des miARN
- Identification de haute confiance des sites cibles de miARN
- Aperçus sur la manière dont les miARN régulent des voies biologiques spécifiques.
Soutien à la découverte de cibles médicamenteuses
- Identifier les RBP ou les régions d'ARN impliquées dans des voies liées à la maladie.
- Étudier comment les médicaments expérimentaux affectent les interactions ARN-protéines.
- Trouver des biomarqueurs potentiels pour le développement de médicaments.
Exigences d'échantillon
Notre service de typage HLA fournit des données à haute résolution adaptées pour soutenir diverses applications de recherche. Voici un aperçu rapide de la manière d'interpréter les résultats.
| Type d'échantillon | Quantité recommandée | Quantité Minimale | Concentration Minimale | Notes spéciales |
|---|---|---|---|---|
| Cellules | ≥ 1×10⁷ – 3×10⁷ cellules | — | — | Le nombre dépend de l'abondance de la protéine cible et de la méthode CLIP-seq. |
| Tissu | ≥ 10 – 500 mg | 10 – 200 mg | — | Le montant varie en fonction du type de tissu et de la protéine cible. Consultez CD Genomics pour des détails spécifiques. |
| ARN IPed | ≥ 100 ng | 40 ng | ≥ 5 ng/μL | Applicable si vous soumettez de l'ARN purifié après immunoprécipitation. |
1. Qu'est-ce que le CLIP-seq et pourquoi est-il important ?
CLIP-seq combine le croisement UV, l'immunoprécipitation et le séquençage pour cartographier les interactions ARN-protéine à l'échelle du transcriptome. Cela fournit des informations précises sur la façon dont les protéines liant l'ARN régulent l'expression génique de manière post-transcriptionnelle.
2. En quoi le CLIP-seq diffère-t-il du RIP-seq ?
La méthode RIP-seq extrait des complexes ARN-protéine sans réticulation, ce qui entraîne plus de bruit de fond et une identification des sites de liaison moins précise. La méthode CLIP-seq utilise la réticulation par UV pour capturer interactions directes in vivo, offrant spécificité plus élevée et résolution à un nucléotide unique .
3. Quelle résolution puis-je attendre des variantes de CLIP-seq comme iCLIP ou PAR-CLIP ?
iCLIP capture des cDNAs tronqués aux sites de liaison, permettant résolution à l'échelle des nucléotides individuels et l'emplacement précis de liaison protéine-ARN.
PAR-CLIP, en utilisant des nucléosides photoactivables, introduit des mutations caractéristiques (par exemple, T en C) qui aident à localiser les sites de liaison jusqu'à des nucléotides spécifiques.
4. Comment les données CLIP-seq sont-elles traitées et analysées ?
L'analyse typique comprend :
- Retrait des adaptateurs, codes-barres moléculaires/rognage des codes-barres
- Cartographie des lectures sur un génome de référence Appel de pics pour identifier les sites de liaison
- Découverte de motifs et vérifications de la qualité des sites de liaison
- Les pipelines comme CLIPipe, PureCLIP et PEAKachu sont couramment utilisés pour des flux de travail d'analyse robustes.
5. Quels types d'échantillons et quelles quantités d'entrée sont nécessaires ?
Le CLIP-seq nécessite généralement 10 à 30 millions de cellules ou 10–500 mg de tissu, en fonction de la méthode spécifique. Des variantes comme GoldCLIP ou irCLIP peuvent accepter des entrées plus faibles, mais le rendement global et l'abondance des protéines sont des considérations critiques. Il est préférable de consulter CD Genomics pour des conseils spécifiques aux échantillons.
6. CLIP-seq peut-il détecter des modifications de l'ARN comme le m6A ?
Oui. Des méthodes variées telles que miCLIP-seq combiner CLIP avec des anticorps ciblant des bases d'ARN modifiées—en particulier m6A—pour cartographier les nucléotides modifiés avec une résolution au niveau du nucléotide unique, aidant à comprendre régulation épitranscriptomique.
7. Comment valider la spécificité des anticorps dans le CLIP-seq ?
Un CLIP-seq de haute qualité repose sur des anticorps validés. Les chercheurs doivent s'assurer que leurs anticorps sont spécifiques et fonctionnent bien dans l'immunoprécipitation. Des outils comme le Western blot et l'IP-qPCR sont recommandés avant de procéder au CLIP-seq.
8. Quels contrôles sont nécessaires dans les expériences de CLIP-seq ?
Des contrôles tels que échantillons d'entrée, entrée de taille correspondante (ETC) pour eCLIP, et Contrôles IgG ou sans anticorps sont essentiels. Ces contrôles aident à distinguer les véritables événements de liaison du bruit de fond.
9. Comment choisir entre les différentes méthodes de variantes de CLIP ?
- Utilisez iCLIP pour un mappage précis des nucléotides.
- Choisissez PAR-CLIP pour un signal fort via des nucléosides photoréactifs.
- Considérez GoldCLIP ou irCLIP pour des protocoles plus sûrs sans radioactivité.
- Utilisez eCLIP pour des contrôles d'entrée standardisés et une robustesse de reproduction.
Étude de cas : Interactions mRNA de PRRC2B cartographiées par PAR-CLIP-seq
Journal : Nucleic Acids Research
Facteur d'impact : 19,160 (2022)
Publié : 2023
Contexte
Les protéines liant l'ARN (RBP) jouent des rôles cruciaux dans la régulation de l'expression génique post-transcriptionnelle, influençant des processus tels que l'épissage, la traduction et la stabilité de l'ARN. Cependant, les fonctions et les motifs de liaison de nombreuses RBP restent mal caractérisés. Cette étude s'est concentrée sur PRRC2B, une RBP mal comprise suspectée d'influencer la progression du cycle cellulaire et les voies liées au cancer. Les chercheurs visaient à identifier les sites de liaison de l'ARN à l'échelle du génome de PRRC2B et à explorer son rôle fonctionnel dans la régulation de la traduction.
Matériaux et Méthodes
Préparation des échantillons
- Ligne cellulaire : HEK293T
- Incorporation de l'analogue de ribonucléoside photoréactif 4-thiouridine (4SU)
- Réticulation UV à 365 nm
- Immunoprécipitation et séquençage
- Immunoprécipitation des complexes PRRC2B-ARN
- Préparation de la bibliothèque et séquençage PAR-CLIP
- Cartographie des lectures sur le génome humain
- Identification des sites de mutation induits par les agents de réticulation (CIMS)
- Analyse des motifs
- Profilage des ribosomespour l'efficacité de la traduction
- Essais fonctionnels incluant l'interruption de PRRC2B et des expériences de sauvetage
Résultats
- Identification du site de liaison de PRRC2B
- Les sites de liaison à l'échelle du génome de PRRC2B ont été cartographiés avec une résolution d'un seul nucléotide.
- PRRC2B se lie préférentiellement près des régions du codon de départ d'un sous-ensemble de mARN.
- Les motifs enrichis comprenaient des séquences riches en CU ou GA dans les UTR 5' et les séquences codantes.
- Conséquences fonctionnelles de la liaison de PRRC2B
- La réduction de PRRC2B a conduit à :
- Traduction réduite des ARNm cibles
- Niveaux réduits de protéines régulatrices du cycle cellulaire, y compris CCND2
- Arrêt en phase G1/S et réduction de la prolifération cellulaire
- Des oligonucléotides antisens perturbant la liaison de PRRC2B à des motifs spécifiques ont réduit la traduction de CCND2.
- Aperçus Mécanistiques
- PRRC2B interagit avec les facteurs d'initiation de la traduction eIF3 et eIF4G2 de manière indépendante de l'ARN.
- Les mutations perturbant les interactions de PRRC2B avec les facteurs d'initiation n'ont pas réussi à réparer les défauts de traduction causés par la réduction de PRRC2B.
La protéine PRRC2B riche en proline se lie à des motifs riches en CU ou GA sur des ARNm spécifiques, facilite leur traduction en interagissant avec eIF4G2 et eIF3, et favorise la progression du cycle cellulaire et la prolifération cellulaire.
Conclusion
Cette étude fournit la première carte complète et haute résolution des interactions PRRC2B-ARN dans les cellules humaines, démontrant que PRRC2B se lie près des sites de départ de la traduction et améliore la traduction des régulateurs clés du cycle cellulaire. La perturbation de ces interactions altère la progression du cycle cellulaire, suggérant un nouveau mécanisme de contrôle translationnel. Ces informations mettent en évidence PRRC2B comme un potentiel nœud régulateur dans la biologie du cancer et les voies de prolifération cellulaire.
Référence
- Jiang, F., Hedaya, O. M., Khor, E. S., et al. (2023). La protéine de liaison à l'ARN PRRC2B médie la traduction de mARN spécifiques et régule la progression du cycle cellulaire. Recherche sur les acides nucléiques. PMC10287950
