Analyse des sites d'intégration du virus associé à l'adénovirus (AAV)

Où se trouve le site d'intégration du génome AAV ?

Les vecteurs de virus associés à l'adénovirus (AAV) sont connus pour leur capacité à transduire efficacement des transgènes dans diverses cellules somatiques au sein des organes des patients. Bien qu'ils soient traditionnellement considérés comme des vecteurs épisomaux, les génomes AAV peuvent s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, avec des fréquences d'intégration variant de 0,1 % à 3 % dans différents types de cellules telles que les hépatocytes, les fibroblastes, les cellules musculaires et les neurones. Des hotspots d'intégration ont été identifiés à des sites génomiques caractérisés par des séquences palindromiques, des îlots CpG, des sites de démarrage de transcription (TSS) et des gènes actifs.

Un site d'intégration significatif est le locus AAVS1, qui est situé au sein du gène PPP1R12C sur le chromosome 19 du génome humain. Ce site est reconnu pour sa capacité à accueillir l'insertion de gènes exogènes tout en maintenant une expression génique stable sans nuire à la fonction cellulaire normale et au développement. Par conséquent, AAVS1 est souvent désigné comme un site de « havre de paix », ce qui en fait une cible idéale pour l'édition génétique et d'autres applications.

Comment AAV s'intègre-t-il ?

L'intégration de l'AAV dans le génome de l'hôte est un processus complexe qui dépend fortement des facteurs de l'hôte, car les vecteurs AAV n'encode pas les protéines nécessaires à l'intégration. L'intégration de l'AAV se produit généralement à des sites de cassures double brin (DSB) ou de coupures dans le génome de l'hôte. Cette intégration peut se faire par recombinaison homologue ou par des mécanismes de jonction non homologue des extrémités. La présence d'extrémités chromosomiques libres disponibles pour la ligature avec les génomes AAV suggère que les protéines nucléaires impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN jouent un rôle critique dans la régulation du processus d'intégration.

Bien que des études précliniques et cliniques aient indiqué un profil de sécurité favorable pour les intégrations AAV, des préoccupations subsistent concernant leur potentiel génotoxique à long terme. Des doses élevées d'AAV dans des modèles précliniques ont été associées à un carcinome hépatocellulaire et à des expansions clonales dues à l'activation d'oncogènes. Par conséquent, bien que l'intégration AAV garantisse une expression soutenue du transgène et d'autres avantages potentiels, elle nécessite également une prise en compte minutieuse des mesures de sécurité.

Introduction à l'analyse des sites d'intégration des AAV

L'analyse des sites d'intégration des AAV est un outil de recherche crucial pour comprendre les interactions génomiques entre les vecteurs AAV et les cellules hôtes. Bien que les vecteurs AAV persistent principalement dans un état épissomal, une partie des génomes viraux peut s'intégrer dans le génome hôte, soulevant des questions sur les préférences d'insertion et les risques potentiels.

CD Genomics utilise une approche à haute résolution centrée sur le séquençage d'enrichissement ciblé par capture hybride à lecture courte (TES). Cette méthode utilise des sondes biotinylées pour capturer sélectivement les fragments de jonction AAV-hôte à partir d'ADN génomique fragmenté, permettant une détection sensible des insertions de pleine longueur et tronquées. Contrairement aux méthodes basées sur l'amplification, le TES ne nécessite pas d'extrémités génomiques intactes et fournit une couverture impartiale des événements d'intégration. Associée à des pipelines bioinformatiques sur mesure, cette stratégie soutient un profilage précis et à haut débit des paysages d'intégration AAV.

Avantages du service d'analyse des sites d'intégration AAV

• Caractérisation complèteLe service d'analyse des sites d'intégration AAV de CD Genomics permet la caractérisation détaillée des sites d'intégration AAV, ce qui est essentiel pour comprendre les effets à long terme des vecteurs AAV sur le génome de l'hôte.
• Évaluation de la sécurité amélioréeEn identifiant les points chauds d'intégration et les insertions oncogéniques potentielles, notre service aide à atténuer les risques associés à la mutagenèse d'insertion et garantit la sécurité.
• Stratégies optimiséesLes informations provenant des analyses des sites d'intégration des AAV permettent d'affiner les approches, facilitant une délivrance ciblée et minimisant les effets indésirables associés à l'intégration aléatoire.
• Soutien à la conformité réglementaireUne analyse complète du site d'intégration est de plus en plus requise pour les soumissions réglementaires. Nos services aident les clients à respecter les normes réglementaires nécessaires.

Applications de l'analyse des sites d'intégration des AAV

Le service d'analyse des sites d'intégration AAV proposé par CD Genomics a de vastes applications dans divers domaines, y compris :

• Recherche en oncologie : L'analyse des sites d'intégration est cruciale dans la recherche en oncologie, en particulier pour évaluer la génotoxicité des vecteurs AAV et leur potentiel de tumorigenèse.
• Études en immunologie : L'intégration des AAV peut être utilisée pour des avantages dans les applications immunologiques, telles que l'amélioration de la fonctionnalité des cellules T ou le traitement des immunodéficiences.
• Modèles animaux : L'analyse du site d'intégration dans des modèles précliniques fournit des données précieuses sur les effets potentiels de l'administration d'AAV et aide à prédire les résultats.

Flux de travail d'analyse des sites d'intégration AAV

L'ADN génomique est extrait d'échantillons de tissus ou de cellules traités par AAV. Des bibliothèques sont construites et enrichies en utilisant une capture hybride basée sur des lectures courtes TES ciblant les jonctions AAV-hôte. Un séquençage en paires de 150 pb Illumina est effectué pour générer une couverture à haute profondeur. Les données sont traitées via un pipeline personnalisé pour l'identification des sites d'intégration, la cartographie des points chauds et l'analyse de l'expansion clonale.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon gDNA>500 ng OD260/280=1,8 - 2,0 Pas de dégradation Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Séquençage d'enrichissement ciblé basé sur la capture hybride Illumina NextSeq ou Novaseq Plateforme PacBio
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de qualité et découpe d'adaptateurs Alignement de lecture aux génomes de référence hôte et AAV Détection de la fusion AAV-hôte Analyse de la fréquence des sites d'intégration Clustering de points chauds et annotation génomique Profilage de l'expansion clonale Estimation du nombre de copies de vecteur Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont uniquement à titre de référence. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Données brutes
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données

Références

1. Dalwadi D A, Calabria A, Tiyaboonchai A, et al. Intégration de l'AAV dans les hépatocytes humains. Thérapie Moléculaire, 2021, 29(10) : 2898-2909.
2. Greig J A, Martins K M, Breton C, et al. Les génomes de vecteurs intégrés peuvent contribuer à l'expression à long terme dans le foie des primates après l'administration d'AAV. Biotechnologie de la Nature, 2023 : 1-11.
3. Henckaerts E, Dutheil N, Zeltner N, et al. L'intégration spécifique au site du virus associé à l'adénovirus implique une duplication partielle du locus cible. Actes de l'Académie nationale des sciences, 2009, 106(18) : 7571-7576.
4. Dyall J, Szabo P, Berns K I. Intégration spécifique au site du virus associé à l'adénovirus (AAV) : Formation de jonctions AAV–AAVS1 dans un système in vitro. Actes de l'Académie nationale des sciences, 1999, 96(22) : 12849-12854.
5. Calabria A, Cipriani C, Spinozzi G, et al. La livraison intrathymique d'AAV entraîne une intégration thérapeutique spécifique au site aux loci TCR chez les souris. Blood, Le Journal de la Société Américaine d'Hématologie, 2023, 141(19) : 2316-2329.

Les résultats partiels sont montrés ci-dessous :

Référence

1. Dalwadi D A, Calabria A, Tiyaboonchai A, et al. Intégration de l'AAV dans les hépatocytes humains. Thérapie Moléculaire, 2021, 29(10) : 2898-2909.

1. Quels sont les avantages de l'analyse du site d'intégration des AAV ?

L'analyse des sites d'intégration des AAV caractérise les schémas d'intégration, évalue la sécurité, affine les approches et soutient la conformité réglementaire.

2. Comment CD Genomics réalise-t-il l'analyse des sites d'intégration AAV ?

Le processus comprend la collecte d'échantillons, l'extraction d'ADN, la préparation de bibliothèques, le séquençage, l'analyse bioinformatique et l'interprétation des données.

3. Comment la qualité des données de séquençage est-elle assurée ?

Des mesures de contrôle de la qualité, telles que FastQC, sont utilisées pour vérifier la qualité des données de séquençage avant l'analyse.

4. L'analyse des sites d'intégration peut-elle prédire des préoccupations potentielles en matière de sécurité ?

L'analyse identifie des points chauds d'intégration et des insertions oncogéniques potentielles, aidant à évaluer les risques associés à la mutagenèse d'insertion.

Les génomes vectoriels intégrés peuvent contribuer à l'expression à long terme dans le foie des primates après l'administration d'AAV.

Journal : Nature Biotechnology
Facteur d'impact : 68,164
Publié : 06 novembre 2023

Contexte

Les approches AAV basées sur le foie atteignent initialement une forte expression du transgène chez les primates non humains, mais connaissent une diminution au cours de 90 jours, se stabilisant à des niveaux plus bas. L'étude révèle que l'expression médiée par AAV implique une phase de courte durée à partir des génomes épisomaux et une phase à long terme à partir des vecteurs intégrés, avec des intégrations génomiques détectées dans une petite fraction de cellules.

Matériaux et Méthodes

Résultats

L'étude a examiné les facteurs affectant l'expression des transgènes dans les systèmes AAV hépatiques en utilisant des macaques rhésus et la glycoprotéine β-choriogonadotrope (rh-β-CG) comme transgène. Elle a évalué les vecteurs AAV8 et AAVrh10 à travers des biopsies hépatiques à différents moments. Les résultats ont indiqué que les niveaux de protéine rh-β-CG atteignaient un pic tôt et se stabilisaient à des niveaux plus bas, tandis que l'ADN et l'ARN du vecteur diminuaient avec le temps, l'ARN restant stable lors des évaluations ultérieures.

Fig. 1 : Pic initial suivi d'une diminution vers des niveaux stables plus bas de l'auto-transgène après administration intraveineuse de vecteurs AAV à des NHP.

L'étude a révélé que les vecteurs AAV s'intègrent dans l'ADN chromosomique sous forme de structures concatémeriques complexes, avec des fréquences d'intégration élevées observées dans des hépatocytes non exprimants. En utilisant le séquençage des répétitions terminales inversées (ITR-seq), les chercheurs ont identifié des événements d'intégration dans l'ADN hépatique, révélant une distribution étendue à travers le génome, en particulier près des gènes hépatiques hautement exprimés. Notamment, aucun des sites d'intégration n'était situé dans des régions associées aux mutations du carcinome hépatocellulaire. Des expansions clonales ont été analysées, indiquant que les animaux exposés à certains vecteurs avaient des loci plus étendus. De plus, le séquençage à long terme a démontré une diversité de séquences AAV in vivo, mettant en évidence des réarrangements et des truncations qui se sont probablement produites après l'administration.

Fig. 2 : Localisation de l'ADN vectoriel intégré après administration intraveineuse de vecteurs AAV chez des NHP.

Fig. 3 : Structure de l'ADN vectoriel intégré après administration intraveineuse de vecteurs AAV à des NHP.

Conclusion

L'étude montre que l'AAV dans les foies de primates est influencé par les réponses immunitaires et la réparation de l'ADN. Des domaines nucléaires persistants de l'ADN du vecteur coexistent avec une diminution de l'expression du transgène, indiquant un potentiel de silençage. Des intégrations à faible fréquence suggèrent que l'expression précoce dépend des formes épisomales. Améliorer l'efficacité pourrait impliquer de promouvoir l'activité épisomale et de cibler les intégrations pour leur durabilité.

Référence

1. Greig J A, Martins K M, Breton C, et al. Les génomes vectoriels intégrés peuvent contribuer à l'expression à long terme dans le foie des primates après l'administration d'AAV. Biotechnologie de la Nature, 2023 : 1-11.