Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que le séquençage PCR multiplex ?
La séquençage PCR multiplex de CD Genomics combine la réaction en chaîne par polymérase multiplex (PCR) avec séquençage de nouvelle génération (NGS). Il utilise plusieurs paires d'amorces dans un seul tube de réaction pour amplifier simultanément de nombreuses régions génomiques spécifiques (contenant des SNP cibles). Les amplicons regroupés sont ensuite séquencés sur des plateformes NGS à haut débit (comme Illumina MiSeq/NovaSeq), permettant le génotypage parallèle de centaines de SNP à travers de nombreux échantillons. Cette méthode est très spécifique, sensible et efficace pour des études ciblées.
Nous utilisons notre logiciel propriétaire AIdesign et MFEprimer pour la conception de primers multiplex et le contrôle qualité, développé avec l'aide d'experts reconnus au niveau international. Cette solution de pointe fournit des primers spécifiques au génome entier basés sur des algorithmes de stabilité thermodynamique, adaptés à vos besoins de recherche. Avec la capacité de multiplexage allant jusqu'à 5 000 réactions dans un seul tube et des exigences d'entrée aussi faibles que 100 pg d'ADNg, cette méthode enrichit rapidement et efficacement les régions cibles pour un séquençage précis. Nous proposons deux formats de conception flexibles : tube unique ou plusieurs tubes, en fonction de votre type de région cible.
Conception de primers et flux de travail PCR multiplex. Le diagramme de flux décrit le processus de sélection et d'optimisation des primers pour l'amplification PCR, en veillant à l'absence de cheveux ou de dimères, et à la génération d'amplicons spécifiques. Le diagramme à droite illustre les pools de primers pour l'amplification de l'ADN cible.
Choisissez la bonne méthode de typage SNP pour votre recherche
Choisir la bonne approche de génotypage est essentiel pour l'efficacité et la précision. Bien que les options varient du séquençage Sanger à faible débit au séquençage génomique à large couverture, le séquençage par PCR multiplex établit l'équilibre optimal pour les études ciblées : haut débit, rentable et flexible pour des panels de SNPs de taille modérée. Que ce soit pour valider des biomarqueurs, dépister des cohortes ou réaliser des essais en agrigénomique, cela élimine les compromis des méthodes traditionnelles.
| Méthode | Débit | Coût/Échantillon | Vitesse | Flexibilité | Meilleur pour |
|---|---|---|---|---|---|
| Séquençage PCR multiplex | Élevé | $$ | Rapide | Élevé | Panneaux ciblés (10-500 SNPs), validation, grandes cohortes |
| Essais TaqMan | Moyen | $$$$ | Rapide | Bas | Petits ensembles de SNP (<10), validation, diagnostics |
| Séquençage de Sanger | Très bas | $$$$$ | Lent | Moyen | Gènes uniques, confirmation à faible débit |
| Séquençage du génome entier | Très élevé | $$$$ | Lent | Très élevé | Découverte, génomique à grande échelle, assemblage de novo |
| Séquençage de l'exome entier | Élevé | $$$$ | Modéré | Élevé | Découverte dans les régions codantes, variantes rares |
| Microarrays SNP | Très élevé | $$ | Rapide | Bas | GWAS, génotypage à grande échelle (préconçu) |
Applications de séquençage PCR multiplex
Le séquençage PCR multiplex est une méthode ciblée et à haut débit qui analyse efficacement des régions génomiques spécifiques. Elle fournit des résultats évolutifs et sensibles dans des applications clés, notamment :
Génétique des populations et élevage:
Génotyping SNP à haut débit pour la diversité, le mapping de QTL, la sélection génomique et le breeding assisté par marqueurs ; les plateformes intègrent des amplicons ciblés avec GBS.
Identification humaine et criminalistiqueKits de séquençage d'amplicons ciblés de type iiSNPs, aiSNPs, piSNPs et microhaplotypes ; fonctionnent sur de l'ADN dégradé ou à faible quantité où les STR peuvent échouer.
Panneaux de recherche cliniquePanneaux de variants germinaux et somatiques (oncologie, maladies héréditaires) avec des flux de travail rapides et économiques et une uniformité dans les régions difficiles. Utilisation à des fins de recherche uniquement.
Génomique des maladies infectieuses et des épidémiesLa PCR multiplex en mosaïque permet le séquençage viral de l'ensemble du génome pour identifier les mutations et suivre les variants.
Édition et tests ciblésDétection sensible des modifications CRISPR, des variants de point chaud et des allèles rares ; les options COLD-PCR et les codes-barres moléculaires enrichissent/quantifient les variants à faible fréquence.
Flux de travail du service de séquençage par PCR multiplexe
Chez CD Genomics, nous proposons un service de séquençage Multiplex PCR de bout en bout, fluide et sans couture, pour garantir des résultats cohérents et de haute qualité. Notre flux de travail standardisé — de la soumission des échantillons à la livraison des données — est conçu pour soutenir la reproductibilité, rationaliser la recherche et accélérer la découverte dans tous les types d'études génomiques :
- Soumission d'échantillons et contrôle qualité:
Recevoir et auditer vos échantillons d'ADN (sang, tissu, cellules, écouvillons, salive). Effectuer un contrôle de qualité pour confirmer que la quantité et la pureté répondent aux exigences pour l'amplification multiplex.
- Conception de primers et optimisation de panneaux
Utilisez des outils logiciels avancés et des algorithmes de conception experts pour créer des panneaux de primers multiplex optimisés adaptés à vos régions SNP cibles, garantissant une haute spécificité et une amplification équilibrée.
- Amplification par PCR multiplexe
Effectuez une amplification PCR hautement multiplexée pour enrichir des dizaines à des milliers de régions cibles dans une seule réaction ou des tubes en pool, maximisant le débit tout en maintenant une couverture uniforme.
- Suivant—Séquençage de nouvelle génération
Séquencez les amplicons PCR sur des plateformes NGS à haut débit (par exemple, Illumina MiSeq/NovaSeq) pour générer des lectures profondes et précises pour chaque région cible.
- Traitement des données et bioinformatique:
Traiter les données de séquençage brutes en formats standardisés (FASTQ, BAM, VCF). Appliquer des pipelines d'alignement, d'appel de variants et d'annotation pour fournir des résultats de génotypage fiables.
- Rapport et interprétation:
Fournissez des résultats complets incluant des statistiques résumées, des rapports d'annotation (PDF + Excel), des visualisations graphiques et des conseils d'utilisation pour soutenir vos besoins de recherche ou de publication en aval.
Analyse bioinformatique du séquençage PCR multiplexe
Pour garantir des résultats précis et des informations significatives, notre équipe de bioinformatique utilise un flux de travail complet adapté au séquençage PCR multiplex, permettant un traitement des données fluide et une analyse approfondie des variations génomiques.
Pour une analyse bioinformatique personnalisée ou des besoins de recherche spécifiques, veuillez contacter nos experts pour des conseils professionnels et un soutien adaptés aux exigences de votre projet.
Exigences d'échantillon pour le séquençage PCR multiplex
| Type d'échantillon | Quantité recommandée | Méthode d'expédition |
|---|---|---|
| Génomique ADN | ≥ 100ng, OD260/280 entre 1,8 et 2,0, traité avec RNase | glace bleue |
| Cellule | 1×10⁶ cellules | glace carbonique |
| Tissu congelé frais | 10 mg | glace carbonique |
| Ecouvillons | 2 tubes/échantillon, 1 écouvillon/tube | température ambiante |
| Salive | 1 mL | glace carbonique ou glace bleue |
| Sang total | 1 mL de sang frais dans un tube EDTA | glace carbonique |
| 4 mL de sang congelé dans un tube EDTA | glace carbonique |
Remarque : Ce sont des recommandations générales. Pour des besoins spécifiques au projet, contactez notre équipe technique pour des conseils personnalisés.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le séquençage PCR multiplex ?
Des plateformes de séquençage avancées à la livraison de données de haute qualité, CD Genomics propose une solution efficace, de bout en bout, adaptée à divers besoins de recherche. Notre équipe garantit des résultats fiables avec un soutien flexible.
- Expertise scientifique prouvéeSoutenue par une équipe de scientifiques de niveau doctorat et de bioinformaticiens expérimentés, nous avons réussi à aider de nombreux instituts de recherche et entreprises agricoles à atteindre leurs objectifs de génotypage.
- Conception de primers optimiséeNos algorithmes de conception de primers propriétaires sont conçus pour maximiser la spécificité et minimiser les effets hors cible, garantissant une amplification équilibrée même dans des régions génomiques complexes.
- Contrôle de qualité completNous mettons en œuvre des protocoles stricts d'assurance qualité à chaque étape, de la validation des échantillons à la préparation des bibliothèques et au séquençage, garantissant l'intégrité des données et leur reproductibilité.
- Personnalisation FlexibleQue vous ayez besoin d'un petit panel ciblé ou d'un dépistage à haute densité, nous proposons des solutions entièrement personnalisables avec un support technique dédié pour s'aligner sur vos objectifs de recherche spécifiques.
Références :
- Onda, Yu, et al. "Séquençage d'amplification ciblée par PCR multiplex (MTA-Seq) : génotypage SNP simple, flexible et polyvalent par séquençage d'amplification PCR hautement multiplexé." Frontières en science des plantes 9 (2018) : 201. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00201
- Sato, Mana, et al. "Une méthode de génotypage hautement flexible et répétable pour les études d'aquaculture basée sur le séquençage d'amplicons cibles utilisant la technologie de séquençage de nouvelle génération." Rapports Scientifiques 9 (2019) : 6904. https://doi.org/10.1038/s41598-019-43336-x
- Wang, Xiaoming, et al. "Une nouvelle technologie de génotypage SNP, le séquençage cible SNP, et son application dans l'analyse génétique des variétés de concombre." BMC Genomics 21 (2020) : 24. https://doi.org/10.1038/s41598-020-62518-6
- Ruff, T. M., Marlowe, K., Hooker, M. A., Liu, Y., & See, D. R. (2023). Génotypage par séquençage multiplexé (GMS) utilisant des marqueurs SNP. Dans les méthodes en biologie moléculaire. (Vol. 2638, pp. 9–21). Humana. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
Résultats de la démo
Résultats de démonstration de séquençage PCR multiplex, montrant le génotypage SNP, la couverture des variants et les applications en agriculture, recherche sur les maladies et criminalistique.
Questions Fréquemment Posées
1. Combien de SNPs puis-je typer dans un seul essai ?
Les chimies d'amplicon modernes prennent en charge des centaines à environ 6000 amplicons en fonction de la complexité du génome, de la conception du panneau et du nombre de pools. Nous recommanderons 1 à 4 pools pour maintenir l'uniformité.
2. Quelle quantité d'ADN ai-je besoin ?
La plupart des panneaux de primers fonctionnent bien avec environ 10 ng par pool ; une plage de 1 à 100 ng est supportée. Pour des échantillons très complexes ou de faible qualité, des entrées plus élevées peuvent améliorer l'uniformité.
3. Comment le séquençage par PCR multiplex se compare-t-il à la capture par hybridation ?
Amplicon offre un enrichissement plus rapide et moins coûteux avec une grande profondeur, tandis que la capture fournit une couverture plus uniforme sur des régions très grandes ou riches en GC avec moins de pertes. Le choix dépend de la taille de la cible et des exigences de sensibilité.
4. Pouvez-vous manipuler de l'ADN FFPE ?
Oui. Des amplicons plus courts (125–175 bp) et des conditions optimisées améliorent le succès sur l'ADN fragmenté/FFPE.
5. Quelle précision puis-je attendre pour les appels SNP ?
Les données publiées montrent une précision d'appel d'environ 95 à 98 % sur des centaines d'amplicons lorsque les conceptions sont optimisées ; nous rapportons la couverture par locus et les taux d'appel pour documenter la performance.
6. Puis-je combiner des amplicons ciblés avec des marqueurs à l'échelle du génome ?
Des stratégies hybrides existent, par exemple, le GTA intègre des amplicons multiplex dans des bibliothèques GBS, ce qui est utile dans les pipelines de sélection.
7. Que faire si j'ai besoin d'un multiplexage extrêmement élevé au-delà des limites de la PCR ?
La technologie MIP (probes d'inversion moléculaire) prend en charge des dizaines de milliers de loci et peut être considérée pour des panneaux SNP très larges.
8. Proposez-vous des panels SNP orientés vers la criminalistique ?
Nous pouvons concevoir des ensembles iiSNP/aiSNP/piSNP ou soutenir l'utilisation de panneaux commerciaux publiés (par exemple, ForenSeq) dans le cadre d'une utilisation à des fins de recherche.
Étude de cas : Génotypage à haut débit des variétés de concombre par séquençage PCR multiplex
Source: Adapté de Wang, X., et al. (2020). Rapports scientifiques.
Contexte
ConcombreConcombre L.) l'élevage nécessite une identification génétique précise pour distinguer les variétés et garantir la pureté des semences. Les méthodes traditionnelles comme KASP sont précises mais coûteuses pour de grands ensembles de marqueurs, tandis que GBS (Génotypage par séquençage) souffre souvent de données manquantes. L'étude visait à valider un Séquençage PCR multiplex méthode (appelée Target SNP-seq) pour identifier efficacement et à moindre coût les variétés de concombre.
Méthodes
Les chercheurs ont conçu un panel de PCR multiplex sur mesure pour génotyper. 261 variétés de concombres.
- Conception de panneauCiblé 163 SNPs parfaits avec un fort polymorphisme à travers le génome.
- Flux de travailUne stratégie de "PCR en deux étapes" a été utilisée pour amplifier les régions cibles et ajouter des codes-barres dans un flux de travail unique.
- SéquençageLes amplicons ont été regroupés et séquencés sur la plateforme Illumina.
- ValidationLes génotypes ont été comparés aux tests KASP pour vérifier leur précision.
Résultats
L'approche de séquençage par PCR multiplex a fourni des indicateurs de performance supérieurs :
- Haute Précision: La méthode a atteint une précision de génotypage de 99,4 % comparé à KASP.
- EfficacitéIl a réussi à identifier 4 sous-populations distinctes (types du Nord de la Chine, du Sud de la Chine, d'Europe et de Xishuangbanna).
- Découverte de marqueurs centraux: Un ensemble de base de 24 SNPs a été identifié qui pourrait distinguer plus de 99 % des variétés.
Structure de la population et analyse PCA de 261 variétés de concombre génotypées par séquençage PCR multiplex (séquençage SNP ciblé).
Conclusions
Cette étude démontre que le séquençage PCR multiplex est un outil robuste, flexible et très économique pour le génotypage des cultures. Il permet aux sélectionneurs de construire des empreintes génétiques ADN précises et de dépister rapidement de grandes collections de germoplasme, accélérant ainsi considérablement les programmes de sélection moléculaire.
