Séquençage CRISPR

CD Genomics propose une validation de knockout CRISPR-Cas9 et une détection potentielle des effets hors cible de manière hautement efficace et rentable en exploitant des technologies avancées. séquençage de nouvelle génération (NGS)Nos membres d'équipe ont de l'expérience à la fois en édition génomique et en NGS, ce qui permet un soutien étendu à votre recherche.

Qu'est-ce que CRISPR ?

CRISPR, abréviation de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées, est une technologie révolutionnaire d'édition génétique provenant des systèmes immunitaires naturels des bactéries et des archées. Ce système est un élément crucial de la défense immunitaire des procaryotes, permettant à ces organismes de capturer des fragments d'ADN viral et de les utiliser pour détecter et détruire des séquences virales similaires lors d'infections ultérieures. En essence, CRISPR permet aux virus d'intégrer leur matériel génétique dans les bactéries, exploitant la machinerie cellulaire bactérienne pour répliquer leurs propres gènes, un processus que nous appelons l'édition génétique.

Les composants principaux du système CRISPR comprennent :

• Loci CRISPRCes loci se composent de séquences génétiques répétitives entrecoupées de "spacers", qui sont des fragments d'ADN viral capturés lors d'infections antérieures.
• Protéines Cas (protéines associées au CRISPR)Le Cas9, par exemple, est une enzyme qui peut couper l'ADN à des emplacements spécifiques, guidée par des séquences d'ARN.
• ARN guide (gARN)Il s'agit d'une courte séquence d'ARN complémentaire à la séquence d'ADN cible, dirigeant l'enzyme Cas9 vers le site précis dans le génome où l'édition est souhaitée.

Qu'est-ce que le système CRISPR-Cas9 ?

Le système de ciblage génétique CRISPR-Cas9, nécessitant deux composants : un ARN guide personnalisé (sgRNA, composé d'une séquence crRNA spécifique à la cible et d'un tracrRNA) et une endonucléase associée au CRISPR non spécifique (Cas9), est un nouvel outil d'ingénierie génomique qui permet aux chercheurs de modifier des parties du génome en supprimant, ajoutant ou altérant une section de la séquence d'ADN dans un organisme. C'est actuellement la méthode de manipulation génétique la plus simple, la plus polyvalente, précise et efficace, avec de nombreuses applications potentielles, y compris en médecine et dans l'amélioration des semences de cultures. CRISPR-Cas9 a également été adapté pour permettre l'édition génomique à haut débit et a révolutionné la génération de mutations ciblées.

Introduction au séquençage CRISPR

Le séquençage CRISPR est une méthodologie avancée qui intègre la technologie d'édition génétique CRISPR avec séquençage à haut débit, visant à manipuler précisément le génome et à analyser les effets résultants. CRISPR, acronyme de Groupes de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées, dérive d'un mécanisme immunitaire bactérien et utilise des protéines Cas (associées à CRISPR) guidées par des molécules d'ARN spécifiques pour cibler et éditer des séquences d'ADN. Cette technique permet non seulement des modifications ciblées du génome, mais aussi une analyse en profondeur des résultats, offrant un potentiel significatif tant en recherche fondamentale qu'en biotechnologie appliquée.

Dans les expériences CRISPR, la validation des modifications génétiques est primordiale. Le séquençage à haut débit (NGS) offre une approche simple et à haut débit pour l'examen des mutations souhaitées, compte tenu de la possibilité d'occurrence de modifications hors cible au lieu des modifications génétiques prévues. Le séquençage d'amplicons CRISPR est devenu la technique de validation standardisée dans les domaines académique, clinique et industriel. Le criblage CRISPR à haut débit s'appuie sur les principes du séquençage d'amplicons ciblés en utilisant des amorces flanquant les régions cibles pour l'amplification par PCR. Le séquençage d'amplicons ciblés se présente comme la méthode la plus sensible pour la détection des mutations, capable d'identifier des mutations avec des fréquences aussi basses que 0,01 %.

Pour répondre aux besoins émergents des communautés de recherche, CD Genomics a développé une stratégie abordable, fiable et à haut débit pour le dépistage et la validation des mutations basées sur CRISPR-Cas9 en tirant parti du séquençage de nouvelle génération basé sur des amplicons. Notre service de séquençage de nouvelle génération CRISPR peut vous fournir des informations directes et détaillées sur la nature et la diversité des mutations, y compris la confirmation des allèles knockout/knockin, l'évaluation de l'efficacité de coupe des sgRNAs, l'identification homozygote et hétérozygote, et le calcul des fréquences de mutation. et al..

Avantages de notre service de séquençage CRISPR

• La haute précision du système CRISPR/Cas9 permet un ciblage et un édition précis de loci génomiques spécifiques.
• Cette polyvalence facilite une variété de modifications génomiques, y compris les knockouts de gènes, les knock-ins, les mutations ponctuelles et la régulation des gènes.
• Flexibilité de multiplexage étendue et séquençage à haut débit, jusqu'à 10⁴ échantillons par course
• Séquençage ultra-profond d'amplicons ou de régions capturées, avec une couverture supérieure à 1000X
• Détection économique et hautement sensible sans biais.
• Pas besoin d'étapes de clonage laborieuses et chronophages.
• Soutien dédié de scientifiques spécialisés de niveau doctorat

Applications du séquençage CRISPR

• Génomique fonctionnelle : Ce domaine étudie la fonction des gènes et les rôles que les gènes jouent dans les processus biologiques, offrant une compréhension complète des contributions génomiques aux différentes activités cellulaires.
• Thérapie génique : En se concentrant sur la correction des mutations pathogènes responsables des maladies héréditaires, la thérapie génique vise à restaurer la fonction normale des gènes et à atténuer les symptômes de la maladie.
• Biotechnologie agricole : Cette discipline implique l'amélioration des caractéristiques des cultures, telles que la résistance aux maladies et le rendement, par le biais de modifications génétiques, contribuant ainsi à la productivité et à la durabilité agricoles.
• Recherche sur le cancer : Dédiée à l'élucidation des rôles des gènes liés aux tumeurs, la recherche sur le cancer explore les mécanismes de l'oncogenèse et de la progression du cancer, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Flux de travail de séquençage CRISPR

Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité en suivant chaque procédure pour garantir des résultats complets et précis. Notre flux de travail de séquençage de mutations CRISPR est décrit ci-dessous, y compris l'isolement de l'ADN, les expériences de PCR, le séquençage profond et l'analyse des données. Notre séquençage de mutations CRISPR permet aux chercheurs de valider la bibliothèque de guides, de valider les cibles CRISPR/Cas9 et l'efficacité des mutations, ainsi que de découvrir les sites cibles les plus prometteurs.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Types d'échantillons : échantillons de cellules ou d'ADN après manipulation par édition génique CRISPR-Cas. Échantillon d'ADN : ~1 μg (concentration ≥ 30 ng/μl ; OD260/280=1,8~2,0) Échantillon cellulaire : 1×106 cellules ou 10 cm2 culture cellulaire Les procédures de préparation des échantillons couvrent l'isolement, la purification, la quantification de l'ADN et le contrôle qualité. etc.. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateformes Illumina HiSeq, paire de lectures de 150 pb ou 300 pb ; plateforme SMRT de PacBio. Profondeur de séquençage : ≥ 1000x Analyse des métriques de qualité de séquençage
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle qualité des données brutes Alignement de référence Validation des bibliothèques CRISPR Analyse des loci cibles Analyse des loci hors cible prévus Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage CRISPR pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose des services complets pour détecter les effets hors cible potentiels grâce à l'enrichissement ciblé et au séquençage profond, le tout à des prix compétitifs. Nos capacités avancées nous permettent de séquencer des centaines d'échantillons simultanément, garantissant un traitement efficace et un haut débit. Les schémas de distribution des insertions et des délétions (InDels) seront minutieusement analysés, et les mutations seront vérifiées à l'aide de l'outil CRISPResso robuste. Si vous avez d'autres besoins ou questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Les résultats partiels sont montrés ci-dessous :

1. Le CRISPR-Cas9 est-il un séquençage de nouvelle génération ?

Séquençage de nouvelle génération (NGS) joue un rôle intégral à différentes étapes des flux de travail d'édition du génome CRISPR-Cas9. Ses applications vont du séquençage génomique complet pour analyser les effets hors cible potentiels du CRISPR, au séquençage ciblé visant à confirmer des knockouts de gènes spécifiques et d'autres modifications. En utilisant le NGS, les chercheurs peuvent obtenir une validation détaillée et précise des modifications induites par le CRISPR, garantissant l'exactitude et la fiabilité de leurs altérations génétiques.

2. Quelles sont les considérations éthiques du séquençage CRISPR ?

Le séquençage CRISPR soulève des préoccupations éthiques, notamment en ce qui concerne le potentiel de mutations hors cible et les implications de l'édition de la lignée germinale. Les directives éthiques soulignent la nécessité d'évaluations de sécurité rigoureuses, du consentement éclairé et de la transparence dans la recherche impliquant des technologies d'édition génétique.

3. Comment les chercheurs garantissent-ils la spécificité des résultats de séquençage CRISPR ?

Les chercheurs utilisent des outils de bioinformatique pour analyser les données de séquençage et distinguer les mutations induites par CRISPR des bruits de fond ou des erreurs de séquençage. De plus, des techniques de validation telles que Séquençage de Sanger ou la PCR digitale par gouttelette (ddPCR) peut confirmer la présence de mutations à des loci génomiques spécifiques.

4. Comment le séquençage CRISPR est-il utilisé dans la recherche clinique et la thérapie ?

Dans le domaine de la recherche clinique, le séquençage CRISPR joue un rôle intégral dans l'avancement des perspectives thérapeutiques pour les troubles génétiques. Cette technologie facilite la validation précise des modifications génomiques dans les cellules dérivées de patients, permettant ainsi aux chercheurs d'examiner en profondeur l'efficacité et les profils de sécurité des thérapies géniques avant les essais cliniques. De plus, le séquençage CRISPR est essentiel pour élucider les mécanismes de la maladie et identifier des cibles thérapeutiques potentielles, favorisant une compréhension plus approfondie qui pourrait conduire au développement de stratégies de traitement innovantes.

Analyses des effets hors cible à l'échelle du génome de l'ingénierie des récepteurs des cellules T médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules T humaines primaires.

Journal : Immunologie clinique et translationnelle

Facteur d'impact : 5,8

Publié : 23 janvier 2022

Contexte

L'utilisation des cellules T pour la défense contre le cancer est une approche prédominante dans les stratégies immunothérapeutiques contemporaines. L'ingénierie génétique de Récepteurs des cellules T (TCR) permet la redirection de la spécificité des cellules T, l'élimination de l'alloréactivité et l'avancement de la thérapie par transfert de cellules T adoptives (ACT). L'introduction de cassures double brin de l'ADN via la technologie CRISPR/Cas9 facilite les manipulations de knockout ou de knock-in des gènes. Une méthode efficace pour évaluer la sécurité des cellules T modifiées consiste à détecter les gènes hors cible dans l'ensemble du génome. En s'appuyant sur les techniques CRISPR/Cas9, les auteurs ont utilisé la livraison de ribonucléoprotéines pour inactiver le TCR, leur permettant d'évaluer la sécurité des cellules T génétiquement modifiées. Séquençage du génome entier a ensuite été employé pour enquêter sur la question de savoir si les cassures double brin médiées par CRISPR/Cas9 aux sites TCR sont associées à des effets hors cible dans des cellules T primaires.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Fig 1. Analyse du génome entier des effets hors cible induits par Cas9 dépendants de gRNA.

Fig 2. Séquençage profond ciblé des événements hors cible pré-identifiés par le séquençage du génome entier (WGS).

La sécurité des cellules T a été évaluée en examinant les incidents hors cible induits par une nucléase non spécifique. En utilisant Cas-OFFinder, les auteurs ont recherché des sites correspondants avec un décalage de ≤ 4 entre l'ARN guide (gRNA) et l'ADN non cible, les considérant comme des emplacements possibles hors cible. Par la suite, un séquençage du génome entier a été réalisé sur des échantillons non traités et des échantillons MOCK. Les résultats ont révélé que l'électroporation seule n'avait entraîné aucune variation génomique significative.

Les auteurs ont ensuite réalisé un séquençage du génome entier sur des échantillons soumis à des modifications TRAC et TRBC, en excluant les InDels trouvés dans les échantillons non traités et MOCK. En utilisant un alignement de séquences homologues du génome entier basé sur l'ARN guide unique (sgRNA), ils ont identifié 316 InDels distincts dans les échantillons modifiés TRAC et 272 InDels distincts dans les échantillons modifiés TRBC. Ces sites potentiels hors cible ont ensuite été compilés par les auteurs.

Conclusion

En résumé, cette étude examine la sécurité de l'ingénierie génétique médiée par CRISPR/Cas9 dans les récepteurs des cellules T (TCR), visant à évaluer les effets hors cible. En utilisant une approche combinée de prédiction de cibles biaisées, de séquençage du génome entier sans biais et de séquençage profond ciblé, l'étude a confirmé une haute efficacité dans l'élimination des TCR sans détecter de mutations InDel hors cible induites par CRISPR/Cas9. Cependant, des recherches supplémentaires in vivo sont nécessaires pour évaluer pleinement la sécurité clinique des produits de cellules T génétiquement modifiés.

Référence

1. Kaeuferle T, Stief T A, Canzar S, et al. Analyses des effets hors cible à l'échelle du génome de l'ingénierie des récepteurs des cellules T médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules T humaines primaires. Clinique & Immunologie translationnelle, 2022, 11(1) : e1372.