Séquençage du génome AAV

Qu'est-ce que le génome AAV ?

Le génome de l'AAV (Virus Associé à l'Adenovirus) est une molécule d'ADN simple brin (ssDNA) petite mais hautement fonctionnelle, s'étendant sur environ 4,7 kilobases (kb). Ce paquet génétique compact est ingénieusement conçu avec plusieurs caractéristiques clés :

• Répétitions terminales inversées (RTIs)Situées aux deux extrémités du génome, ces séquences répétitives sont cruciales pour le cycle de vie du virus. Elles forment des structures en épingle à cheveux distinctives qui sont essentielles pour le processus de réplication et l'emballage du génome viral. Ces ITR jouent également un rôle clé dans l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte.
• Gènes de représentationLes gènes Rep (Réplicatifs) codent pour des protéines essentielles à la réplication du génome AAV et à la régulation de son cycle de vie. Ces protéines sont impliquées dans la fabrication de copies de l'ADN viral et peuvent également aider à intégrer le matériel génétique du virus dans le génome de l'hôte, garantissant ainsi que le virus puisse persister et se propager efficacement.
• Cap GènesLes gènes Cap produisent les protéines qui constituent la coque protectrice du virus, ou capside. Ces protéines de capside ne sont pas seulement des composants structurels ; elles déterminent la capacité du virus à infecter des types spécifiques de cellules. Elles contribuent également à la stabilité du virus et à son efficacité à délivrer sa charge génétique.
• Régions régulatricesCes régions gèrent l'expression des gènes Rep et Cap. Elles agissent comme des contrôleurs de la circulation, veillant à ce que la production des protéines virales se fasse au bon moment et en quantités appropriées tout au long du cycle de vie du virus.

Qu'est-ce que le séquençage NGS de l'AAV ?

NGS (Séquençage de nouvelle génération)Séquençage de nouvelle génération) de l'AAV offre une plongée approfondie dans le génome viral, révélant une richesse d'informations sur sa structure et ses problèmes potentiels. Cette technologie de pointe cartographie méticuleusement l'ensemble du génome AAV, identifiant les variants génétiques, les mutations et les contaminants possibles. De telles informations détaillées sont cruciales pour peaufiner les vecteurs AAV utilisés en thérapie génique, garantissant qu'ils sont à la fois sûrs et efficaces. De plus, le NGS aide à déterminer la concentration exacte d'AAV dans les échantillons et confirme la pureté des préparations de vecteurs, s'assurant qu'elles sont exemptes d'éléments viraux ou bactériens indésirables. En essence, le NGS est un outil vital qui soutient le développement précis, le contrôle qualité rigoureux et l'application réussie des thérapies géniques basées sur l'AAV.

Introduction au séquençage du génome AAV

Les AAV sont actuellement l'un des vecteurs les plus largement utilisés et significatifs pour la livraison de thérapie génique in vivo. Ces vecteurs peuvent délivrer des charges génétiques allant jusqu'à 4,7 kb et peuvent infecter une grande variété de types cellulaires avec une pathogénicité minimale. La production des AAV commence par la construction de plasmides et se termine par l'emballage dans des particules virales. En raison des caractéristiques structurelles du génome AAV, produire des virus AAV avec un ADN de haute fidélité est intrinsèquement difficile. Pour faire face à ces complexités, CD Genomics propose des solutions complètes de séquençage du génome AAV et de contrôle de qualité conçues pour optimiser la qualité des vecteurs AAV.

L'électrophorèse sur gel d'agarose, la PCR/ddPCR et le Southern blotting ont été largement utilisés pour l'évaluation de la taille du génome AAV et l'identification de régions spécifiques. Cependant, ces méthodes sont limitées dans leur capacité à fournir des informations complètes sur les séquences et des aperçus sur l'intégrité génomique. Les techniques de séquençage de troisième génération, remarquables pour leurs capacités de lecture longue, ont été développées comme des solutions potentielles pour l'analyse de l'intégrité du génome AAV. Néanmoins, la nature intrinsèque du génome AAV en tant qu'ADN simple brin (ssDNA) nécessite sa conversion en ADN double brin avant la préparation de la bibliothèque pour le séquençage de troisième génération.

Ce processus de conversion, associé aux terminaisons modifiées présentes dans les génomes AAV, entrave l'analyse précise des séquences terminales. De plus, les génomes AAV fragmentés, étant plus courts que leurs homologues intacts, présentent un biais significatif lors de la préparation des bibliothèques et du séquençage, entraînant une représentation disproportionnée dans les ensembles de données de séquençage. Par conséquent, l'analyse de l'intégrité du génome AAV à l'aide du séquençage de troisième génération donne souvent des résultats qui sous-estiment l'intégrité réelle, entraînant une distorsion des données. Cette distorsion a de graves implications pour les examens de conformité ultérieurs et le processus d'approbation des médicaments. Par conséquent, bien que le séquençage de troisième génération soit adapté à une analyse précise des séquences des génomes AAV, il est inadéquat pour l'évaluation des séquences terminales et de l'intégrité globale du génome.

À la lumière des exigences réglementaires croissantes, des protocoles de détection robustes et des méthodes analytiques sont essentiels pour garantir la sécurité et la conformité des AAV. CD Genomics a lancé des services de séquençage du génome AAV et de contrôle de qualité basés sur des technologies de séquençage à haut débit. En utilisant la deuxième génération (NGS) et troisième génération (Séquençage en temps réel à molécule unique) analyses de séquençage, nous examinons la pureté des AAV, l'intégrité de la séquence ITR et la précision de la séquence cible. Nos services sont conçus pour aider les clients dans le développement de médicaments de thérapie génique à améliorer leurs processus de production d'AAV, garantissant ainsi la sécurité des essais cliniques ultérieurs.

Avantages de notre service de séquençage du génome AAV

• Résultats PrécisGrâce à des méthodologies de séquençage précises, nous réalisons un séquençage complet des régions ITR, identifiant efficacement et avec précision les sites de mutation au sein de ces séquences.
• Séquençage rapideNotre approche garantit que le séquençage des régions ITR est réalisé rapidement, ce qui entraîne des délais d'exécution accélérés pour la livraison des résultats.
• Services de consultation completsCD Genomics offre un support technique continu tout au long du cycle de vie du projet, que ce soit lors des étapes initiales, intermédiaires ou finales.
• Séquençage ITR axé sur la conformitéCD Genomics exploite des laboratoires entièrement accrédités, équipés d'instruments à la pointe de la technologie, respectant strictement les systèmes de gestion de la qualité et les procédures opérationnelles normalisées (SOP).

Applications du séquençage du génome AAV

Recherche sur la thérapie génique

• Optimisation des vecteurs AAV
• Évaluation des résultats thérapeutiques

Édition du génome

• Analyse de l'efficacité
• Validation de la spécificité

Développement de vaccins

• Optimisation du système de livraison
• Évaluation de l'immunogénicité

Recherche fondamentale

• Exploration du mécanisme d'infection
• Impact des variants viraux

Flux de travail de séquençage du génome AAV

Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité en suivant chaque procédure pour garantir des résultats complets et précis. Notre flux de travail de séquençage AAV est décrit ci-dessous, y compris la préparation de la bibliothèque, le séquençage et l'analyse bioinformatique.

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon échantillon d'ADNg ≥ 500 ng pour le séquençage sur la plateforme Illumina échantillon d'ADNg ≥5ug pour le séquençage sur la plateforme PacBio Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateforme Illumina PE150, sortie de données de 10 Go Plateforme PacBio, lectures CCS de 7 à 10K
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données Alignement à la séquence du plasmide et au génome de référence de l'hôte Examiner l'intégrité du génome Détection de l'hétérogénéité Identification des contaminants ADN Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage du génome AAV pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics utilise le séquençage du génome entier par lectures courtes pour réaliser le séquençage du génome AAV, intégrant Séquençage de Sanger et des plateformes à haut débit pour des évaluations complètes. Cette approche permet d'examiner l'intégrité du génome, de détecter l'hétérogénéité et d'identifier les contaminants ADN dans les préparations de bibliothèques AAV. Nous sommes déterminés à tirer parti de notre vaste expertise et de notre technologie de pointe pour offrir des services supérieurs et des produits de haute qualité adaptés aux besoins spécifiques de nos clients.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

1. Pourquoi choisir les AAV pour la thérapie génique ?

AAV se distingue dans la thérapie génique en raison de son profil de sécurité élevé, de sa faible immunogénicité, de sa stabilité physique, de son large tropisme cellulaire et de son expression prolongée in vivo. Ces attributs font de l'AAV l'un des vecteurs les plus couramment utilisés dans ce domaine. La construction de vecteurs basés sur l'AAV est une pierre angulaire de la technologie de thérapie génique.

Les chercheurs ont entrepris des études approfondies pour optimiser les vecteurs AAV. Ces efforts incluent la modification de la structure génomique du vecteur viral, l'augmentation de sa capacité de charge, l'amélioration du rendement viral et l'optimisation de l'efficacité de transduction à travers différents types de tissus. De telles modifications visent à adapter les vecteurs AAV pour répondre aux besoins spécifiques de différentes maladies.

2. Pourquoi le coût des AAV est-il si élevé ?

• Exigences de pureté pour les vecteurs AAV

Les vecteurs AAV doivent répondre à des normes de pureté strictes. Les capsides virales vides peuvent déclencher des réponses immunitaires et rivaliser avec les vecteurs entièrement encapsulés pour infecter les cellules du patient, nécessitant des doses plus élevées pour atteindre l'efficacité thérapeutique. Cette augmentation de la posologie non seulement accroît le risque d'effets secondaires liés à des doses élevées, mais augmente également la toxicité hépatique potentielle et le risque de carcinogénicité. Par conséquent, la réalisation d'une validation approfondie de la pureté après la construction du vecteur AAV devient une étape essentielle.

• Taux de mutation élevés dans des structures ITR spécifiques

Le génome de l'AAV est flanqué à ses deux extrémités par des séquences de répétition terminale inversée (ITR), qui sont cruciales pour l'emballage et la réplication de l'rAAV. Cependant, les régions ITR dans les plasmides AAV sont instables en raison de leurs séquences palindromiques et de leur forte teneur en GC, ce qui les rend sujettes à des mutations ou des délétions lors de la réplication bactérienne. Même avec les protocoles expérimentaux les plus standardisés, les plasmides AAV peuvent présenter des taux de mutation allant de 5 % à 15 %.

• Défis dans la détection des ITR

Étant donné la fréquence élevée des mutations dans les ITR, il est crucial d'évaluer l'intégrité des régions ITR dans les plasmides avant l'emballage viral. Cependant, ces régions sont riches en séquences palindromiques capables de former des structures secondaires stables. Lors du séquençage Sanger, ces boucles en épingle à cheveux stables peuvent inhiber l'amplification PCR, entraînant des interruptions de séquençage et compliquant la validation des séquences. De même, la méthode conventionnelle utilisant l'enzyme de restriction SmaI pour vérifier l'intégrité des ITR peut être insuffisante, car de petites délétions peuvent échapper à la détection par électrophorèse sur gel.

3. Quels sont les avantages d'utiliser l'AAV comme vecteur pour la thérapie génique ?

AAV présente plusieurs avantages, notamment une faible immunogénicité, une large gamme d'hôtes, des propriétés physico-chimiques stables et une expression à long terme des gènes exogènes.

Plus précisément, ces avantages sont :

• Profil de sécurité élevéAAV est généralement non pathogène pour les humains ou peut seulement provoquer des symptômes très légers.
• Intégration cibléeAAV peut s'intégrer spécifiquement dans le site AAVS1 sur le chromosome 19 humain, ce qui réduit le risque de mutagenèse d'insertion liée à l'intégration aléatoire observée avec d'autres vecteurs viraux.
• Expression génique soutenueLes systèmes de transfert de gènes médiés par AAV facilitent l'expression persistante et stable des gènes introduits, qui peuvent être régulés par des éléments génétiques environnants.
• Large éventail d'hôtesAAV peut infecter une grande variété de types cellulaires, y compris les cellules en division et les cellules non divisantes.
• Stabilité thermique et chimiqueLe système de transfert AAV démontre une stabilité thermique significative et une résistance aux conditions acides et alcalines, ainsi qu'aux solvants organiques, ce qui le rend pratique pour le stockage.

Le séquençage de la population du génome du virus associé à l'adénovirus atteint une résolution complète du génome du vecteur et révèle des chimères humain-vecteur.

Journal : Méthodes de thérapie moléculaire et développement clinique

Facteur d'impact : 4,771

Publié : 27 février 2018

Contexte

Les virus adéno-associés recombinants (rAAV) nécessitent un contrôle qualité précis pour la thérapie génique. Les méthodes traditionnelles comme la qPCR et l'électrophorèse sur gel ne capturent pas pleinement la fragmentation du génome ou la contamination. Séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT) fournit une vue détaillée des génomes rAAV complets et tronqués, révélant des erreurs dans l'emballage du génome et une contamination par des fragments de cellules hôtes ou viraux. Cette technique avancée offre une analyse complète des populations de vecteurs rAAV.

Matériaux et Méthodes

Résultats

AAV-GPseq utilise le séquençage SMRT pour analyser les génomes scAAV de longueur complète des ITR 5' à 3'. Il révèle que les cassettes shRNA conduisent à des génomes plus tronqués et permet une caractérisation détaillée des orientations des ITR et des ratios de brins positif/négatif, fournissant des informations sur l'emballage et la dynamique de réplication des vecteurs AAV.

Figure 1. Profilage de la résolution à particule unique des génomes scAAV par AAV-Gpseq.

AAV-GPseq révèle que la plupart des lectures de génomes de vecteurs sont plus courtes que 500 pb, ce qui diffère de l'analyse sur gel. En utilisant de l'ADN de spike-in pour la normalisation, elle quantifie avec précision les génomes de pleine longueur par rapport aux génomes tronqués. Cette méthode montre que les vecteurs de pleine longueur sont moins présents que ne le suggèrent les résultats traditionnels sur gel.

Figure 2. Évaluation de l'abondance des populations de génomes AAV hétérogènes.

AAV-GPseq détecte les séquences de backbone de plasmides dans les génomes de vecteurs en révélant des lectures qui s'étendent au-delà des régions ITR. Cette méthode identifie les lectures qui s'alignent avec les séquences de backbone de plasmides, suggérant la présence de génomes emballés à l'envers ou de taille supérieure à la longueur unitaire. L'analyse confirme également que de nombreux génomes courts, de moins de 500 pb, incluent des séquences ITR mais ne sont pas présents à des niveaux détectables dans les échantillons de vecteurs purifiés.

Figure 3. Alignements des populations de vecteurs hétérogènes au référentiel pCis-Plasmide.

Conclusion

Les méthodes traditionnelles d'évaluation de l'intégrité des vecteurs rAAV sont limitées dans le profilage des génomes individuels. AAV-GPseq fait progresser cela en analysant les génomes de l'ITR à l'ITR, révélant des séquences chimériques et des structures de plasmides. Malgré ses atouts, des défis subsistent, notamment la sous-représentation des séquences chimériques plus longues et des limitations avec les AAV à brin simple. Dans l'ensemble, AAV-GPseq améliore l'évaluation de la qualité et de la sécurité des vecteurs de thérapie génique.

Référence

1. Tai P W L, Xie J, Fong K, et al. Le séquençage de la population du génome du virus associé à l'adénovirus atteint une résolution complète du génome du vecteur et révèle des chimères humain-vecteur. Méthodes de thérapie moléculaire & Développement clinique, 2018, 9 : 130-141.