Service de génotypage des microsatellites

CD Genomics a une vaste expérience dans le soutien à la sélection et à la conception de marqueurs de microsatellites pour un large éventail d'espèces végétales et animales. En plus du génotypage des microsatellites, nous proposons également génotypage par séquençage (GBS) méthode, qui permet d'économiser du temps et des ressources.

L'introduction du génotypage par microsatellites

Les microsatellites, également connus sous le nom de répétitions de séquences simples (SSR) ou de répétitions en tandem courtes (STR), ont été des marqueurs populaires en raison de leur fort polymorphisme. Génotypage est une approche précise, rentable et rapide pour distinguer les allèles de microsatellites, renforcée par des avancées techniques successives, y compris le PCR multiplex. séquençage de nouvelle génération technologies. Le flux de travail complet pour le génotypage des microsatellites comprend l'acquisition de données de séquençage, la sélection des SSR, la conception des amorces, la validation des amorces, la PCR multiplexée et l'électrophorèse en gel capillaire couplée à une détection par fluorescence, ainsi que l'analyse des données.

La réaction PCR est réalisée avec des amorces marquées par un colorant fluorescent, puis les fragments PCR peuvent être analysés sur une capillaire. Séquençage de l'ADN machine, et les données sont analysées à l'aide de GeneMapper^TM logiciel. En tirant parti du multiplexage par taille de fragment et par couleur de teinture, ainsi que de la capacité des machines d'analyse génétique fluorescente automatisées à charger automatiquement 16 échantillons à la fois à partir de plaques microtitration de 96 puits ou même de 384 puits, une analyse de marqueurs à haut débit peut être conçue. Ce service a été appliqué à une grande variété d'espèces et peut accueillir toute espèce pour laquelle des marqueurs microsatellites sont disponibles.

Si vous souhaitez en savoir plus sur le génotypage par microsatellite, vous pouvez lire notre article "Introduction aux microsatellites et génotypage des microsatellites.

Avantages du génotypage des microsatellites

Avantages des microsatellites en tant que marqueurs génétiques :

• Universel et polymorphe
• Marqueurs spécifiques à un locus (par opposition aux marqueurs multi-locus tels que les minisatellites)
• Codominant (les hétérozygotes peuvent être distingués des homozygotes)
• Basé sur la PCR (nécessite seulement de petites quantités de tissu et fonctionne sur de l'ADN dégradé)
• Applications multiples (de l'identification individuelle aux phylogénies à fine échelle)

Application du génotypage par microsatellites

La vaste quantité de données émergentes pour des milliers de marqueurs de microsatellites à travers les organismes fait du génotypage par microsatellite un outil largement accepté pour :

• Analyse de liaison de co-ségrégation
• Diagnostic et identification des maladies humaines
• Identification judiciaire et tests de parenté
• Identification de lignées cellulaires
• Études de population

Flux de travail de génotypage des microsatellites

CD Genomics adopte des plateformes avancées (ABI 3730xl DNA Analyzer) et des stratégies (PCR multiplex) pour fournir un service de génotypage de microsatellites rapide et précis, ainsi qu'une analyse bioinformatique. Notre équipe d'experts hautement expérimentés met en œuvre une gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux. Le flux de travail général est décrit ci-dessous.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon Échantillons de tissus, ou ADN déjà extrait, ou produits de PCR ADN génomique ≥ 500 ng, Quantité minimale : 200 ng, Concentration ≥ 10 ng/μl, OD260/280 = 1,8 ~ 2,0 Produits PCR avec une haute spécificité Tous les échantillons d'ADN sont validés pour leur pureté et leur quantité.
	PCR multiplexage et génotypage Sélection SSR à partir de données de séquence Conception et validation des amorces PCR multiplexage Électrophorèse capillaire sur analyseur d'ADN ABI 3730xl
	Analyse de données Précision de taille Appel et regroupement des allèles Analyse de regroupement Mesurer et rapporter les taux d'erreur Diversité génétique et études de population Plus sur demande

Pipeline d'analyse

Livrables

• Procédure expérimentale complète,
• Images d'électrophorèse PCR
• Images de détection de gel grandes
• Chromatogrammes de séquençage
• Résultats de l'analyse des données

CD Genomics propose un service complet de génotypage des microsatellites, incluant la conception et la commande de paires d'amorces marquées par fluorescence, la validation des amorces, le génotypage des microsatellites, ainsi que l'analyse des données. Nous pouvons adapter ce processus à vos intérêts de recherche. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

1. Qu'est-ce que le génotypage des microsatellites ?

Le génotypage des microsatellites est une technique puissante utilisée pour la détection et l'évaluation des variations au sein des microsatellites, également connus sous le nom de répétitions de séquences simples (SSR), dans l'ADN. Les microsatellites sont de courtes séquences répétées composées de 1 à 6 paires de bases. Ces séquences sont considérablement variables à travers le génome, ce qui en fait d'excellents marqueurs génétiques.

2. Quel est le principe sous-jacent au génotypage des microsatellites ?

Le génotypage des microsatellites repose sur le principe de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l'amplification de sites microsatellites spécifiques. Cette technique implique la conception d'amorces spécifiques pour amplifier des régions microsatellites ciblées. Par la suite, les produits amplifiés sont différenciés et typés en fonction des variations de taille par des techniques telles que l'électrophorèse sur gel ou l'électrophorèse capillaire.

3.Quels sont les avantages de la technologie de génotypage des microsatellites ?

L'utilisation de la technologie de génotypage par microsatellites présente plusieurs avantages distincts dans les études de variation génétique :

• Polymorphisme Prominent : Les microsatellites se caractérisent par leur degré élevé de variabilité, fournissant ainsi une abondance d'informations génétiques.
• Résolution Précise : Cette technologie d'investigation permet une différenciation très précise, mettant en évidence même les variations génétiques minimes entre les organismes individuels.
• Distribution large : Les marqueurs de microsatellites envahissent largement le génome, ce qui rend cette technique adaptée à différentes espèces biologiques.

4. En quoi le génotypage par microsatellites diffère-t-il des autres technologies de génotypage ?

Le génotypage des microsatellites est distinct de Génotypage des polymorphismes mononucléotidiques (SNP) dans plusieurs aspects critiques :

• Polymorphisme amélioré : Lorsqu'on le compare à Génotypage SNPLe génotypage par microsatellites présente un niveau de polymorphisme supérieur, ce qui le rend particulièrement adapté à l'exploration de régions génétiques hautement variables.
• Différentes finalités d'application : Alors que le génotypage SNP trouve traditionnellement son utilité dans l'analyse des mutations ponctuelles, le génotypage des microsatellites excelle dans les études nécessitant une compréhension plus détaillée de la variabilité génétique.

5. Comment les données de génotypage des microsatellites peuvent-elles être traitées et analysées ?

Les procédures pour le traitement et l'analyse des données de génotypage par microsatellites comprennent :

• Détermination de la taille des fragments : La mesure des tailles de fragments à partir des électrophorégrammes utilise un logiciel spécialisé.
• Génotypage: En fonction de la taille des fragments, l'identification des allèles aux loci de microsatellites se produit.
• Analyse statistique : Les données génotypiques sont analysées avec des logiciels statistiques pour révéler la variabilité génétique et la structure des populations.

Le génotypage de microsatellites à haute profondeur et haute précision permet une classification précise du risque de cancer du poumon.

Journal : Oncogène
Facteur d'impact : 7,519
Publié : 31 juillet 2017

Contexte

Les microsatellites sont une série de séquences d'ADN en tandem comprenant de courtes unités répétitives (1-6 pb). Des recherches récentes ont mis en évidence le rôle essentiel que jouent ces microsatellites dans le processus complexe du développement génétique à travers une myriade de types de cancer. L'objectif principal de cette étude est d'identifier certains marqueurs de microsatellites applicables à la stratification du risque pour le cancer du poumon. Cela serait réalisé en comparant les séquences d'exome germinal entre des patients atteints de cancer du poumon et un groupe de contrôle normatif.

Méthodes

Résultats

La méthodologie adoptée est principalement divisée en deux étapes : (i) identification des sites de microsatellites (MST), et (ii) validation de leur statut en tant que marqueurs significatifs. En utilisant des données provenant de The Cancer Genome Atlas (TCGA) comprenant 488 échantillons de tumeurs germinales de cancer du poumon non à petites cellules, et du Projet 1000 Genomes ayant 399 échantillons de contrôle non cancéreux, la première phase s'est concentrée sur la distinction de la variance génétique dans les sites MST. Cette analyse a conduit à la révélation de 119 sites MST significatifs, suggérant une différence de génotype cruciale entre les échantillons cancéreux et de contrôle. En utilisant des méthodes analytiques similaires, 144 marqueurs MST supplémentaires ont été identifiés dans d'autres types de cancer. La transition vers la deuxième étape a impliqué la conception d'un kit d'enrichissement ciblé sur mesure contenant 263 (119+144) marqueurs MST, complété par 84 marqueurs MST de contrôle pour le séquençage par capture ciblée. La réalisation d'un séquençage profond de 30 échantillons de cancer du poumon et de 89 échantillons de contrôle non cancéreux, avec une profondeur de séquençage moyenne de 579x ± 315, a mis en lumière des différences prononcées au sein de 21 (13+8) marqueurs MST parmi les 263 à l'étude.

Fig 1. Les loci MST de LUAD et LUSC récoltés par calcul différencient leur type de cancer correspondant des échantillons de contrôle non cancéreux des 1000 génomes avec une haute sensibilité (LUAD : 0,87, LUSC : 0,88).

Des études récentes soulignent que différents types de cancer peuvent en effet partager des spectres de caractéristiques oncogéniques communs. En plus de découvrir 13 sites de microsatellites (MST) propices à la stratification du risque de cancer du poumon parmi les données sur le cancer du poumon et les données non cancéreuses, cette étude a également examiné 144 sites de MST provenant d'autres types de cancer, y compris le cancer du sein, le cancer de l'ovaire, le mélanome et les neuroblastomes. Après une vérification rigoureuse, il a été discerné que 8 de ces marqueurs pouvaient être utilisés efficacement dans le cadre de l'évaluation du risque de cancer du poumon.

Tableau 1 Loci MST qui peuvent différencier précisément les échantillons de cancer du poumon des échantillons non tumoraux.

Fig 2. Les 13 loci MST spécifiques au cancer du poumon et 8 loci MST spécifiques à d'autres maladies peuvent différencier les groupes d'échantillons de cancer du poumon et de témoins non cancéreux.

Un examen plus approfondi de ces 13 sites MST a révélé leur emplacement au sein de la région intronique des gènes. Des recherches antérieures ont suggéré que le MST dans la région intronique pourrait influencer le processus de variante d'épissage et la transcription des gènes. Une analyse de cluster de ces 13 gènes dans la base de données DAVID a révélé un aperçu d'enrichissement significatif tant dans les variantes d'épissage que dans les produits de transcription. Une analyse d'association de ces 13 gènes liés au cancer du poumon a indiqué que seulement REL et ARID1B ont été identifiés dans des recherches antérieures comme étant liés au cancer. Les implications du TCGA suggèrent que ces deux gènes pourraient précipiter l'apparition du cancer du poumon par des mécanismes de dommages à l'ADN et de remodelage de la chromatine.

Conclusion

• Une analyse complète des données liées au cancer provenant de TCGA et du Projet des 1000 Génomes a capturé 263 sites MST (119+144) exprimant des variations génotypiques significatives parmi les échantillons de cancer et de contrôle.
• En utilisant le séquençage de capture ciblé, une validation d'échantillon efficace pour ces sites MST a été réalisée, révélant 21 (13+8) marqueurs MST capables de faciliter une stratification du risque de cancer du poumon supérieure.
• La soumission des 13 sites MST filtrés à une analyse de regroupement et d'enrichissement a permis de conclure qu'ils pourraient influencer les mécanismes de dommages à l'ADN et de remodelage de la chromatine, entraînant ainsi le cancer du poumon. Cet effet se produit principalement par le biais de REL et ARID1B.
• Les sites MST non découverts ont une valeur clinique potentiellement significative. Leur découverte est primordiale pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, la prédiction du cancer du poumon et les processus d'évaluation substantielle du risque de cancer.

Référence :

1. Velmurugan KR, Varghese RT, Fonville NC, et al.Le génotypage de microsatellites à haute profondeur et haute précision permet une classification précise du risque de cancer du poumon. Oncogène2017, 36(46):6383-90.