Séquençage de l'ARN bactérien

En plus des eucaryotes Séquençage de l'ARN CD Genomics est également dédié à fournir un service de séquençage d'ARN prokaryote pour faire avancer vos besoins en profilage de l'expression génique bactérienne en utilisant les dernières techniques.

L'introduction du séquençage de l'ARN bactérien

Ces dernières années, séquençage à haut débit des bibliothèques d'ADNc (RNA-Seq) a émergé comme une technologie puissante pour le profilage de l'expression génique, la découverte de gènes précédemment non annotés et la cartographie de l'architecture du transcriptome dans une grande variété d'espèces bactériennes. Avec l'application de RNA-seq des approches dérivées, nous pouvons acquérir des connaissances biologiques sur le monde bactérien et aspirer à percer les mystères liés à l'expression génique, à l'organisation et à d'autres caractéristiques fonctionnelles du génome. Le transcriptome bactérien et métatranscriptome Les informations sont importantes pour prédire la résistance à des antibiotiques spécifiques, comprendre les interactions immunitaires hôte-pathogène, quantifier les changements d'expression génique et suivre la progression de la maladie.

Il existe des différences évidentes dans la construction de bibliothèques cDNA entre le RNA-Seq bactérien et le RNA-Seq eucaryote. La première étape du flux de travail du RNA-Seq bactérien est la sélection des transcrits d'ARNm. La chimie de réduction de l'ARN ribosomal Ribo-Zero est utilisée à la place d'une sélection par queue poly-A, ce qui rend cette méthode particulièrement adaptée aux ARNm bactériens qui n'ont pas de queue poly-A. Après purification, l'ARNm est fragmenté en petits morceaux et copié en cDNA de première chaîne à l'aide de transcriptase inverse et de primers aléatoires. La spécificité de la chaîne est obtenue en remplaçant le dTTP par du dUTP dans le mélange de marquage de la deuxième chaîne (SMM), suivi de la synthèse du cDNA de deuxième chaîne. Grâce à l'utilisation du RNA-Seq spécifique à la chaîne, une compréhension plus complète du transcriptome pourrait être atteinte, ce qui a le potentiel d'identifier de nouveaux niveaux de régulation de l'expression génique.

Avantages du séquençage de l'ARN bactérien

• Annotation précise de la structure des gènes : Séquençage du transcriptome chez les procaryotes, il est possible d'identifier de petits peptides qui peuvent être négligés dans l'annotation du génome, fournissant des informations plus précises sur la structure des gènes.
• Détection et annotation des régions régulatrices non codantes de l'ARNm : Le séquençage du transcriptome révèle des éléments régulateurs importants dans l'ARNm prokaryote, tels que les riboswitches et les sites de liaison des petits ARN, améliorant notre compréhension des mécanismes régulateurs de l'ARNm.
• Étude de la structure et de la fonction des opérons : L'analyse du transcriptome peut déterminer les structures des opérons, faisant progresser notre compréhension de la régulation multifonctionnelle et de l'évolution des transcrits polycistroniques.
• Recherche sur la régulation des ARN non codants : Grâce au séquençage des sRNA procaryotes, nous obtenons des informations sur la fonction et les mécanismes de ces éléments régulateurs dans le contrôle physiologique.
• Plasticité des fonctions des éléments ARN : Le séquençage du transcriptome révèle la polyvalence fonctionnelle des éléments ARN dans différentes conditions, aidant à comprendre leurs rôles dans des environnements variés.

Application du séquençage de l'ARN bactérien

• Étudier les mécanismes moléculaires de régulation des microorganismes liés à différentes étapes, phénotypes et réponses au stress.
• Amélioration des informations sur le transcriptome microbien, y compris la détermination de la structure des transcrits, la prédiction de nouveaux transcrits et l'identification des ARN non codants.
• Niveau d'expression génique
• Niveau de structure des gènes
• Fonction des gènes
• Réseau d'interaction
• Identification des gènes différentiels
• Détection des ARN non codants, etc.

Flux de travail de séquençage de l'ARN bactérien

Les étapes principales impliquées dans le séquençage de l'ARN bactérien commencent par l'extraction de l'ARN total des cellules bactériennes. Cette opération est suivie de l'élimination de l'ARNr, qui prédomine dans l'ARN total, afin d'augmenter sélectivement la population d'ARNm. Par la suite, l'ARNm est converti en ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse. L'ADNc résultant est fragmenté, des adaptateurs sont ligaturés, et une amplification PCR est réalisée pour former la bibliothèque de séquençage. Le séquençage à haut débit est ensuite effectué en utilisant des plateformes telles qu'Illumina ou PacBio. La phase finale comprend un processus d'analyse de données minutieux, englobant l'assurance qualité, l'alignement des séquences, la quantification et l'examen de l'expression différentielle.

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon Quantité d'ARN : ARN total ≥ 1 μg (sans dégradation ni contamination par l'ADN) Cellules ≥ 1x107 OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage HiSeq X ten, 150 PE, 1~3 G/par échantillon MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400
	Analyse bioinformatique Analyse au niveau de la structure des gènes Évaluation de la qualité des données de séquençage Filtrage des données brutes Carte vers le génome de référence Nouvelle prédiction de transcription Analyse des UTR Prédiction de transcrits antisens analyse des sRNA Détection et analyse des SNP Analyse des InDels Analyse du niveau d'expression génique Analyse des niveaux d'expression génique différentielle Annotation GO et KEGG des gènes différentiels. Analyse d'enrichissement GO/KEGG des gènes différentiels. Analyse des réseaux d'interaction des protéines Affichage des résultats de visualisation Remarque : Les résultats de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de l'ARN bactérien pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose une solution rapide et complète de séquençage de l'ARN bactérien, allant du contrôle qualité des échantillons à l'analyse des données. contactez-nous pour plus d'informations et un devis détaillé.

Références

1. Kröger C, MacKenzie K D, Alshabib E Y, et al. Le transcriptome primaire, les petits ARN et la régulation de la résistance antimicrobienne dans Acinetobacter baumannii ATCC 17978. Recherche sur les acides nucléiques, 2018, 46(18) : 9684-9698.
2. Liu X, Shen B, Du P, et al. Analyse transcriptomique de la réponse de Pseudomonas fluorescens à l'épigallocatéchine gallate par RNA-seq. PloS un, 2017, 12(5) : e0177938.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

FAQ sur le séquençage de l'ARN bactérien

1. Pourquoi l'élimination de l'ARNr est-elle nécessaire ?

L'élimination méticuleuse de l'ARN ribosomal (ARNr) revêt une importance capitale dans le séquençage de l'ARN bactérien, en raison de sa présence prédominante dans les échantillons d'ARN bactérien, dépassant souvent 90 % du contenu total en ARN. Comme l'ARN messager (ARNm) - la cible principale des efforts de séquençage - ne constitue qu'une fraction mineure du pool total d'ARN, une déplétion efficace de l'ARNr est indispensable pour atténuer l'abondance écrasante des séquences d'ARNr dans les ensembles de données de séquençage. Négliger l'élimination de l'ARNr peut compromettre de manière significative la précision du séquençage et nuire à la sensibilité de la détection de l'ARNm.

2. Est-il possible de réaliser un séquençage du transcriptome prokaryote sans génome de référence ?

Non, car ce n'est pas pratiquement faisable. L'ARNm procaryote est généralement polycistronique, rendant l'assemblage direct peu fiable.

3. En quoi le séquençage de l'ARN à cellule unique diffère-t-il du séquençage de l'ARN bactérien ?

Le séquençage d'ARN à cellule unique se distingue du séquençage d'ARN bactérien par son accent sur l'étude de l'expression génique au niveau des cellules individuelles, mettant en évidence les variations entre cellules. Contrairement au séquençage d'ARN bactérien, qui examine l'expression génique moyenne d'une population bactérienne, l'unicité du séquençage d'ARN à cellule unique réside dans ses approches distinctes de préparation d'échantillons, d'analyse de données et d'applications potentielles.

Études de cas sur le séquençage de l'ARN bactérien

La revendication de la primauté de l'intestin humain Bacteroides ovatus dans la dégradation diététique du cellobiose

Journal : Microbes Intestinaux
Facteur d'impact : 11,724
Publié : 22 juin 2023

Contexte

la flore intestinale, où elle contribue à la dégradation des fibres alimentaires. Ruminococcus champanellensis, mais des investigations supplémentaires sont impératives pour élucider pleinement ses mécanismes fonctionnels. Les avancées récentes, utilisant Séquençage de l'ARN (RNA-seq) et Séquençage de l'ARNr 16S, se concentrent sur la découverte de nouvelles cellulases et la compréhension des processus complexes sous-jacents à la dégradation de la cellulose dans l'intestin humain.

Méthodes

Résultats

Pour enquêter sur les PUL responsables de la dégradation du cellobiose, BO co-cultivé avec du cellobiose a été soumis à un séquençage d'ARN. Les résultats ont révélé 91 gènes dont l'expression était modifiée en réponse au cellobiose, dont 19 étaient significativement régulés à la hausse par rapport à BO cultivé sur glucose. Ces gènes régulés à la hausse ont été organisés en deux PUL, PUL1 et PUL2, confirmés par RT-qPCR. PUL1, comprenant 15 gènes dont des hydrolases glycosidases (GH5 et GH2) et six protéines hypothétiques, et PUL2, comprenant cinq gènes dont GH16 et GH3, sont impliqués dans la dégradation du cellobiose. Notamment, PUL1 n'avait pas été précédemment rapporté.

Figure 1. Les loci d'utilisation des polysaccharides (PUL) ont été analysés par RNA-seq et confirmés par RT-qPCR.

Pour élucider les voies spécifiques par lesquelles la dégradation du cellobiose est facilitée dans la bactérie, des protéines recombinantes représentant chaque locus d'utilisation des polysaccharides (PUL) ont été isolées et des sérums immunitaires produits pour caractérisation. Évidemment, les protéines BACOVA_02626GH5, BACOVA_02630GH5 et BACOVA_02745GH3 ont montré une régulation spécifique à la hausse en présence de cellobiose, impliquant leur rôle direct dans la dégradation de ce substrat. Grâce à une combinaison d'analyses d'immunofluorescence et de Western blot, il a été établi que BACOVA_02630GH5 se localise principalement à la membrane cellulaire, tandis que BACOVA_02626GH5 et BACOVA_02745GH3 étaient exprimées à des niveaux relativement plus bas à l'intérieur de la cellule. Des évaluations enzymatiques ont en outre confirmé la capacité de BACOVA_02626GH5, BACOVA_02630GH5 et BACOVA_02745GH3 à catalyser la conversion du cellobiose en glucose. Ces observations collectives soulignent le rôle indispensable joué par ces protéines dans la voie de dégradation du cellobiose au sein de la bactérie.

Figure 2. Deux nouvelles cellulases ont été déterminées.

Pour enquêter sur les activités fonctionnelles bactériennes, nous avons utilisé PICRUSt1/2 et Tax4Fun pour mapper les séquences d'ARNr 16S sur des gènes et des voies métaboliques. Le regroupement non supervisé de 49 voies métaboliques MetaCyc prédit a montré des différences significatives entre les groupes véhicule et cellobiose, indiquant des voies métaboliques spécifiques au microbiome de la cellobiose. Tax4Fun a prédit que seule la β-N-acétylhexosaminidase, l'alpha-glucosidase et la β-galactosidase différaient du groupe véhicule. L'analyse PICRUSt1 a révélé des voies KEGG enrichies liées au métabolisme de l'histidine, au méthane, à la biosynthèse de la vitamine B6 et à celle de l'acide folique après traitement à la cellobiose. Le métabolisme de l'histidine et la β-N-acétylhexosaminidase ont montré qu'ils inhibent l'inflammation colique. Le traitement à la cellobiose a diminué les niveaux d'ARNm et de protéines TNF-α et IL-6 et a augmenté l'expression de l'ARNm H2R. Ces résultats suggèrent que la cellobiose pourrait modifier les fonctions métaboliques bactériennes, bien que son impact sur l'inflammation reste flou et nécessite des investigations supplémentaires.

Figure 3. Prédiction de la fonction métabolique des bactéries et détection des facteurs inflammatoires.

Conclusion

Les bactéries cellulolytiques sont cruciales pour la dégradation de la cellulose, mais leurs mécanismes moléculaires restent peu explorés. Le cellobiose, une unité de cellulose, favorise la croissance de la bactérie intestinale clé BO, mais son mécanisme moléculaire n'est pas clair. Cette étude a identifié deux nouvelles cellulases de surface cellulaire dans BO qui dégradent le cellobiose en glucose. Ces cellulases, avec des structures similaires aux enzymes des bactéries du sol, indiquent une adaptation évolutive. Des tests in vivo ont montré que le cellobiose remodelait le microbiote intestinal et réduisait l'inflammation, suggérant des propriétés anti-inflammatoires potentielles. Cette recherche améliore notre compréhension de la dégradation de la cellulose dans l'intestin humain et souligne la nécessité d'explorer davantage les capacités cellulolytiques du microbiote intestinal.

Référence

1. Li M, Wang Y, Guo C, et al. La revendication de la primauté de Bacteroides ovatus humain dans la dégradation du cellobiose alimentaire. Microbes intestinaux, 2023, 15(1) : 2227434.