Directives de Soumission d'Échantillons
Introduction
Le séquençage Hi-C traditionnel a été la pierre angulaire de l'étude de l'architecture génomique en 3D, mais sa limitation aux interactions par paires laisse de nombreuses structures chromatiniennes de haut ordre non résolues. À mesure que les projets de génome avancent vers des assemblages de télomère à télomère (T2T), des organismes polyploïdes et des génomes de plantes et d'animaux complexes, les chercheurs sont confrontés à un défi croissant : Comment pouvons-nous ancrer avec précision les contigs, résoudre les centromères et capturer la véritable complexité de la chromatine ?
La séquençage Pore-C, une méthode de capture de conformation de la chromatine basée sur des lectures longues avec Nanopore, fournit la solution. En séquençant directement des concatémères ultra-longs, la technologie nanopore Pore-C révèle simultanément des interactions chromosomiques multi-facettes et Méthylation de l'ADN, offrant des perspectives au-delà de la portée de Hi-C. Pour les chercheurs dans les laboratoires de biochimie, les collaborations avec des CRO et les institutions académiques, Pore-C ouvre une nouvelle dimension dans l'assemblage du génome et la découverte épigénétique.
Aperçu de la technologie : Qu'est-ce que le séquençage Pore-C ?
Séquençage Pore-C est avancé Technologie de capture de conformation de la chromatine basée sur les nanopores qui surmonte les limitations du Hi-C. En combinant le crosslinking de la chromatine et la ligation avec Séquençage à long fragment d'Oxford NanoporePore-C permet la détection directe de interactions chromatin multi-chemins le long de molécules d'ADN simples.
Comment ça fonctionne
- Réticulation et digestion : Les interactions de la chromatine sont préservées par la fixation au formaldéhyde et la coupure par des enzymes de restriction.
- Ligation : Les fragments d'ADN en proximité spatiale étroite sont ligaturés en concatémères, conservant leurs informations de contact en 3D.
- Séquençage par nanopore : des concatémères ultra-longs sont séquencés directement, capturant plusieurs loci interagissants au sein d'une seule lecture.
- Données intégrées : En plus des interactions chromatiniennes en 3D, le séquençage Pore-C préserve les signaux de méthylation de l'ADN natif, offrant à la fois des informations structurelles et épigénétiques dans un seul flux de travail.
Pourquoi c'est important
- Contrairement à Hi-C, qui est limité aux interactions par paires, le séquençage par nanopore Pore-C fournit des cartes de contact d'ordre supérieur qui reflètent la véritable complexité du repliement de la chromatine.
- Les données d'interaction multi-voies améliorent la précision de l'assemblage du génome de télomère à télomère, la résolution des centromères et l'échafaudage des polyploïdes.
- La détection de méthylation intégrée ajoute une nouvelle dimension à la recherche épigénétique.
Pore-C vs Hi-C : Une nouvelle dimension dans l'analyse du génome
| Fonctionnalité | Hi-C | Pore-C |
|---|---|---|
| Type d'interaction | Paire par paire seulement (deux loci à la fois) | Interactions multi-voies (3+ loci dans une seule lecture) |
| Longueur de lecture | Illumina à lecture courte | Concatémers de nanopores ultra-longs |
| Information épigénétique | Non capturé | Détection directe de la méthylation de l'ADN |
| Profondeur d'ancrage du génome | Nécessite une couverture d'environ 100× | Résultats comparables avec une couverture d'environ 30× |
| Régions complexes | Résolution limitée des centromères | Signaux forts dans les centromères et les répétitions |
| Assemblage polyploïde | Risque accru de mauvaises associations entre homologues | Réduction des faux joints, précision accrue de l'échafaudage |
| Sortie de données | Cartes de chaleur de contact | Cartes de chaleur de contact + réseaux multi-directionnels + pistes de méthylation |
Pourquoi Pore-C surpasse Hi-C
- Des signaux d'interaction plus forts à travers l'ensemble des génomes, y compris les centromères.
- Des assemblages de génomes plus complets dans des espèces diploïdes et polyploïdes.
- Perspectives duales : structure chromatinienne en 3D et modifications épigénétiques.
- Profondeur de séquençage efficace : 30× Pore-C peut égaler la puissance d'ancrage de 100× Hi-C.
Flux de service
Applications du séquençage Pore-C
Séquençage Pore-C offre une solution puissante pour les équipes de recherche cherchant à dépasser les limitations de Hi-C. Avec la capacité de capturer interactions chromatin multi-directionnelles et détecter Méthylation de l'ADN simultanément, analyse de nanopores pore-c soutient un large éventail d'applications dans les sciences de la vie et l'agriculture.
Assemblage et échafaudage du génome
- Renforce l'ancrage des contigs dans les projets de génome de télomère à télomère (T2T).
- Améliore la résolution des centromères, des régions répétitives et des variants structurels.
- Fournit une précision de montage supérieure pour des génomes complexes ou de grande taille.
Recherche sur le génome polyploïde
- Réduit les erreurs d'assemblage en minimisant les signaux croisés des chromosomes homologues.
- Fournit une séparation plus claire des sous-genomes chez les plantes et les animaux polyploïdes.
- Prend en charge le phasage précis des haplotypes et les études évolutives.
Architecture du génome 3D
- Permet de cartographier des structures chromatiniennes de plus haut ordre au-delà des contacts par paires.
- Révèle des réseaux d'interaction multi-directionnels qui régissent la régulation des gènes.
- Fait progresser la compréhension fondamentale de l'organisation nucléaire.
Épigénétique et biologie de la chromatine
- Détecte les motifs de méthylation de l'ADN ainsi que les interactions structurelles.
- Offre une vue intégrée de la régulation épigénétique dans l'espace 3D.
- Facilite la recherche sur le contrôle de l'expression génique, l'imprégnation et le silence.
Sélection des plantes et des animaux
- Accélère la construction du pan-génome et les études de diversité.
- Soutient l'identification des caractéristiques structurelles liées aux traits agronomiques et de résistance aux maladies.
- Fournit des informations de grande valeur pour les programmes d'amélioration génétique.
Stratégies Pore-C recommandées pour différents niveaux de génome
Pour maximiser les avantages de Séquençage Pore-C Dans l'assemblage de génomes, différentes stratégies sont recommandées en fonction du niveau du génome cible. Ces combinaisons garantissent un équilibre optimal entre la précision des lectures, les interactions à longue portée et la profondeur de séquençage.
| Niveau génomique | Stratégie recommandée |
|---|---|
| Génome au niveau des chromosomes | 30× HiFi + 30× Pore-C + 50× NGS |
| Génome T2T | 30× HiFi + 30× ONT ultra-long + 30× Pore-C + 50× NGS |
| Génome T2T parfait | 40–60× HiFi + 60–100× ONT ultra-long + 30× Pore-C + 50× NGS |
| Génome T2T haploïde parfait | 80–120× HiFi + 120–200× ONT ultra-long + 60× Pore-C + 50× NGS |
Analyse de données et bioinformatique
La véritable valeur de Séquençage Pore-C ne réside pas seulement dans la génération de données de concaténation à longue lecture, mais aussi dans l'extraction de signaux d'interaction précis et efficaces. Chez CD Genomics, nous utilisons des méthodes optimisées. pipelines d'analyse de pore-c pour garantir des résultats de haute qualité pour l'assemblage du génome et la recherche sur le génome 3D.
Stratégie d'analyse optimisée
Les pipelines Hi-C traditionnels reposent sur un couper d'abord, aligner ensuite méthode, qui sous-estime souvent le pouvoir unique de Pore-C. Au lieu de cela, nous utilisons un aligner d'abord, couper ensuite approche adaptée aux données Nanopore :
- L'alignement de lecture complète au génome de référence préserve le contexte à longue portée.
- Le découpage de fragments après alignement évite la sur-segmentation et réduit les erreurs de multi-mappage.
- L'extraction précise de paires valides augmente les taux de données utilisables et la résolution des interactions.
Cette stratégie améliore considérablement le débit de données valide comparé aux méthodes conventionnelles, garantissant que chaque lecture Pore-C contribue plus efficacement à l'analyse en aval.
Nouveaux indicateurs de contrôle qualité pour Pore-C
Au-delà de la génération standard de cartes de contact, notre flux de travail en bioinformatique évalue les ensembles de données Pore-C avec des métriques spécialisées, y compris :
- Nombre moyen de fragments – nombre moyen de loci capturés par lecture.
- Ratio Contacts/Lectures – efficacité de la capture d'interaction par lecture.
- Taille valide/Taille totale – proportion des données effectivement utilisées.
- Longueur moyenne des paires valides - distance parcourue par les interactions valides.
Ces indicateurs offrent des perspectives plus approfondies sur les deux. qualité des données et force du signal biologique, garantissant une interprétation fiable.
Livrables
Les clients reçoivent un package de données complet qui peut être directement intégré dans des études génomiques et épigénétiques :
- Données de séquençage Nanopore brutes (FASTQ/FAST5)
- Paires d'interaction traitées (contacts multi-directionnels)
- Cartes de contact de la chromatine et réseaux d'interaction 3D
- Profils de méthylation de l'ADN accompagnés de données structurelles
- Rapport bioinformatique complet avec statistiques de QC et visualisations
Assurance de la qualité des données Pore-C
Le séquençage Pore-C offre une génération de données de haute qualité en se concentrant sur les types d'échantillons optimaux pour des résultats fiables.
| L'indice de séquençage | rendement (/cellule) | |
|---|---|---|
| Espèces conventionnelles | pass lit N50≥1Kb | Données brutes ≥50 Go |
| Description d'échantillon | 1. Il est recommandé d'envoyer des échantillons de plantes constitués de jeunes feuilles nouvellement poussées. 2. Il est recommandé de privilégier les échantillons d'animaux à partir de sang frais, suivi du foie et d'autres tissus. 3. Les échantillons non conventionnels ne garantissent pas le rendement de séquençage. 4. Les échantillons non conventionnels pour le séquençage par nanopore sont les suivants : 1) des plantes avec beaucoup de métabolites secondaires ; 2) océans et produits aquatiques (animaux et plantes, algues, etc.) ; 3) lapins, insectes, amphibiens, oiseaux, etc. |
|
Exigences d'échantillon pour le séquençage Pore-C
Pour garantir des résultats de haute qualité, veuillez suivre les directives ci-dessous lors de la préparation et de l'expédition de vos échantillons. Tous les échantillons doivent être surgelé dans de l'azote liquide, stocké à −80 °C, et expédié le glace carbonique pour éviter la dégradation.
| Type d'échantillon | Montant recommandé |
|---|---|
| Cellule | ≥ 106 cellules |
| Mononucléaires du sang périphérique (PBMC) | Pellet de PBMC à partir d'environ 5 ml de sang total frais |
| Tissu animal | ~50-100 mg de tissu cryo-broyé |
| Matériau insecte | ~50-100 mg de matériau cryo-broyé |
| Matériel C. elegans | ~1 ml de poudre de ver cryogénisé |
| Matériau végétal | ~2 g de matière végétale |
Notes importantes :
- Étiquetez clairement chaque tube avec l'ID d'échantillon (lettres + chiffres) et assurez-vous qu'il correspond au formulaire d'information sur l'échantillon.
- Évitez les cycles de gel-dégel.
- Ne dépassez pas 5 fois les quantités d'entrée recommandées, sauf indication contraire pour les échantillons à faible rendement.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le séquençage de génome complet ?
Des plateformes de séquençage avancées à la livraison de données de haute qualité, CD Genomics propose une solution efficace, de bout en bout, adaptée à divers besoins de recherche. Notre équipe garantit des résultats fiables avec un soutien flexible.
- Expertise ProuvéeNotre équipe possède une vaste expérience dans les techniques de conformation de la chromatine, y compris un travail pionnier avec Pore-C depuis 2022.
- Protocoles optimisés et robustesNous avons affiné chaque étape (réticulations, lyse, ligation, purification) pour un rendement et une complexité maximaux, en minimisant les biais.
- Séquençage à haut débitUn accès direct aux plateformes PromethION 48 garantit une couverture de séquençage approfondie rapidement.
- Bioinformatique avancéeAu-delà des pipelines standard, nous proposons une analyse de contact multi-voies sophistiquée, une intégration et des solutions sur mesure.
- Contrôle de qualité rigoureuxPlusieurs points de contrôle QC garantissent la fiabilité des données.
- Support de bout en boutDe la consultation sur la conception du projet à l'assistance à l'interprétation finale.
Questions Fréquemment Posées (FAQ)
Q : Qu'est-ce que Pore-C et en quoi est-il différent de Hi-C ?
Pore-C est une méthode de capture de la conformation de la chromatine qui utilise le séquençage Nanopore à longues lectures au lieu de courtes lectures ; elle capture des interactions chromatiniennes multi-voies (3 loci ou plus) dans des lectures uniques, préserve la méthylation de l'ADN, simplifie la préparation de la bibliothèque en éliminant le marquage à la biotine et les étapes de PCR, et résout des régions complexes qui sont difficiles à analyser avec Hi-C.
Q : Pore-C peut-il détecter des modifications épigénétiques et des interactions en même temps ?
Oui, parce que Pore-C utilise le séquençage Nanopore qui est sans PCR et conserve les modifications de base de l'ADN natif ; ainsi, à partir du même ensemble de données, il est possible d'obtenir à la fois des réseaux d'interaction de la chromatine et des signatures de méthylation (par exemple 5mC).
Q : Quels types d'échantillons sont adaptés au séquençage Pore-C ?
Des échantillons comprenant des cellules réticulées, des tissus de plantes ou d'animaux, du matériel biologique frais ou congelé pouvant préserver la structure de la chromatine sont appropriés ; Pore-C a été utilisé avec succès pour des lignées cellulaires humaines, des tissus de feuilles de plantes, des types de tissus animaux, nécessitant souvent une fixation et une purification appropriées pour conserver les signaux d'interaction.
Q : Quels sont les types de données et les formats de fichiers typiques issus de l'analyse Pore-C ?
Le flux de travail Pore-C produit des lectures FASTQ ou BAM/concatémères brutes à longue portée, des paires de contacts traitées, des matrices d'interaction multi-voies (cooler/.mcool ou style HiC), une annotation de méthylation et des métriques de contrôle qualité telles que les contacts valides par lecture, le nombre de fragments, et les rapports de contacts inter- versus intra-chromosomiques.
Q : Quelle profondeur de séquençage est nécessaire pour que Pore-C atteigne une assemblage de génome ou une cartographie d'interaction utile ?
La profondeur requise dépend de la taille et de la complexité du génome : pour le scaffolding au niveau des chromosomes, une couverture modérée combinée avec Pore-C suffit souvent ; pour les assemblages de télomère à télomère ou les génomes polyploïdes, une couverture plus élevée en lectures longues et en Pore-C améliore les résultats ; Pore-C atteint généralement un scaffolding comparable à une profondeur Hi-C beaucoup plus élevée avec moins de bases lorsqu'il est correctement traité.
Q : Quels flux de travail en bioinformatique sont utilisés pour l'analyse des données Pore-C ?
Les pipelines typiques utilisent une approche "aligner d'abord, puis fragmenter", cartographiant des lectures longues complètes sur le génome de référence, puis analysant les fragments de ligation en fonction des sites de coupure des enzymes de restriction, extrayant des informations de contacts multiples et des contacts par paires, générant des cartes de contact, un profilage de la méthylation, un contrôle qualité et une visualisation ; des outils tels que wf-pore-c sont couramment utilisés.
Étude de cas : Application de HiPore-C pour découvrir le repliement du génome 3D spécifique aux allèles
1. Contexte
Les captures Hi-C traditionnelles enregistrent des interactions chromosomiques pair à pair, mais elles ne peuvent pas résoudre contacts multi-voies ou topologie à allèle uniqueCette limitation entrave notre compréhension des structures génomiques 3D de haut ordre et de leur variation spécifique au type cellulairePore-C, et sa version optimisée à haut débit (HiPore-C), permettent le séquençage direct de concatémères contenant plusieurs fragments d'ADN ligaturés, permettant ainsi la découverte de interactions multi-fragments et des informations épigénétiques au sein de longues lectures uniques.
2. Méthodes
Les auteurs ont appliqué HiPore-C à l'humain. GM12878 (lymphocyte B) et K562 (érythroleucémie) cellules. Les améliorations dans la préparation de la bibliothèque (digestion par protéinase K + pronase) ont surmonté le colmatage des pores des nanopores et augmenté le rendement de séquençage. Ils ont ensuite intégré Séquençage par nanopores avec le Pipeline MapPore-C, qui cartographie les lectures multi-fragments sur le génome de référence et extrait les deux. interactions multi-voies et Modèles de méthylation de l'ADN.
- Technique clé : HiPore-C avec séquençage ONT PromethION.
- Analyse des données : comparaison avec Hi-C, regroupement des topologies à allèle unique et profilage simultané de la méthylation.
3. Résultats
- HiPore-C a réussi à capturer des structures génomiques 3D canoniques telles que les compartiments A/B, les TAD et les boucles, avec une forte concordance avec Hi-C (r = 0,958 pour les vecteurs propres ; r = 0,868 pour les scores d'isolation).
- Interactions de haut ordre : ~38 % des lectures contenaient des fragments interchromosomiques, révélant des hubs de chromatine actifs et inactifs (voir la Figure 3 à la page 5).
- Résolution à un seul allèle : Lectures regroupées en topologies spécifiques au type cellulaire, même dans des TADs conservés (Figure 5 à la page 10).
- Pertinence fonctionnelle : Au locus de la β-globine, HiPore-C a révélé que les hubs d'activateurs se forment uniquement dans les cellules K562, où les gènes de globine embryonnaires et fœtaux sont exprimés. Dans GM12878, le même locus est resté silencieux (Figure 6 à la page 12).
- Épigénétique : HiPore-C a capturé avec précision la méthylation des CpG, en accord avec le WGBS (r = 0,80), et l'a liée aux structures de la chromatine (Figure 7 à la page 14).
HiPore-C identifie un hub d'activateurs spécifique au type cellulaire au locus de la β-globine, révélant des interactions simultanées entre les activateurs et les gènes de globine fœtale dans les cellules K562, mais pas dans les cellules GM12878.
4. Conclusions
HiPore-C fournit une solution de bout en bout pour explorer le repliement du génome à une résolution d'allèle unique, tout en profilant simultanément la méthylation de l'ADN. Il a révélé des clusters topologiques divers au sein des TAD, des hubs d'activateurs-promoteurs spécifiques au type cellulaire, et une régulation épigénétique intégrée dans l'architecture génomique 3D. Cela démontre son potentiel pour la génomique fonctionnelle, la recherche sur les maladies et l'assemblage de génomes polyploïdes.
Références:
- Sean P. McGinty, Gulhan Kaya, View, Sheina B. Sim et al. CiFi : Capture de conformation de la chromatine à longue lecture précise avec des exigences d'entrée faibles.
- Zhang, Z., Yang, T., Liu, Y. et al. L'assemblage de génome résolu par haplotype et le resequencement fournissent des informations sur l'origine et l'élevage de la rose moderne.. Plante nat.s 10, 1659–1671 (2024).
- Tianyu Yang, Yifan Cai, Tianping Huang et al. Une assemblage de génome de référence sans lacunes de télomère à télomère de l'avocat fournit des ressources utiles pour identifier les gènes liés à la biosynthèse des acides gras et à la résistance aux maladies., Recherche en horticulture, Volume 11, Numéro 7, Juillet 2024, uhae119,
- Jeon, D., Sung, YJ. & Kim, C. Assemblage de génome de niveau chromosomique de haute qualité du wasabi (Eutrema japonicum) 'Magic'. Données Sci 11, 1044 (2024).
- Jonghwan Choi, Taemin Kang, Sun-Jae Park, Seunggwan Shin, Une Assemblage de Génome Référentiel à Échelle Chromosomique et Annoté de Plecia longiforceps Duda, 1934 (Diptères : Bibionidae), Biologie des génomes et évolution, Volume 16, Numéro 10, Octobre 2024, evae205,
- Zhong, JY., Niu, L., Lin, ZB. et al. Le Pore-C à haut débit révèle la topologie à allèle unique et la spécificité par type cellulaire du repliement du génome en 3D.. Nat Commun 14, 1250 (2023).
