Analyse de Longs Amplicons (LAA)

CD Genomics propose un service LAA professionnel et rentable avec une profondeur de séquençage allant de <500 à 10K CCS par échantillon pour répondre à vos besoins de recherche spécifiques.

L'introduction de l'analyse des longs amplicons

L'analyse de longs amplifications (LAA) est une technique de biologie moléculaire conçue pour étudier et examiner des séquences d'ADN étendues. Cette stratégie amplifie principalement de longs fragments d'ADN génomique par la réaction en chaîne par polymérase (PCR) avant le séquençage et l'interprétation des données. Cette méthode a des applications significatives en génomique, en biologie évolutive, en recherche sur les maladies, ainsi que dans d'autres domaines nécessitant des recherches sur la structure complexe des gènes et les variations.

Basé sur les séquences de consensus circulaires (CCS) de PacBio, la polymérase peut copier la même région d'ADN plusieurs fois, ce qui génère des lectures longues et de haute fidélité (>99,9 % de précision de lecture sur une seule molécule). L'analyse des longs amplicons (LAA) utilisant Séquençage à molécule unique en temps réel (SMRT) et le système Sequel produit des CCS hautement précis et phasés à partir de longs amplicons.

Figure 1. Vue d'ensemble de la technologie de séquençage SMRT. (Simon Ardui, et al.., 2018)

Comparé aux plateformes de séquençage à lecture courte, le séquençage à longue lecture de PacBio facilite le séquençage des amplicons ou des fragments capturés allant de plusieurs centaines de paires de bases jusqu'à 10 Kb. Ces longues séquences sont très utiles pour la visualisation des variants, y compris les SNP, les CNV et d'autres variants structurels qui ne nécessitent généralement pas d'assemblage.

Quels sont les avantages de l'analyse de longs amplicons ?

• Haute Précision : Grâce à l'utilisation de polymérases à haute fidélité, l'Analyse de Longs Amplicons réduit les erreurs durant le processus d'amplification, améliorant ainsi la fiabilité des résultats.
• Résolution de régions complexes : LAA peut couvrir et élucider des régions complexes et répétitives au sein du génome, fournissant un ensemble d'informations génomiques plus complet.
• Large applicabilité : La technique est non seulement applicable aux génomes nucléaires, mais elle est également utile pour l'analyse de divers types d'ADN, y compris l'ADN mitochondrial et l'ADN chloroplastique.
• Haute sensibilité de détection : l'analyse de longs amplicons peut identifier et détecter de grandes insertions/délétions, inversions et translocations, augmentant ainsi la sensibilité de détection des variations génomiques complexes.
• Haute Résolution Haplotype : Séquençage à lecture longue peut identifier et différencier divers haplotypes d'un même individu au sein d'un seul amplicon, fournissant des informations détaillées sur la structure des haplotypes et les variations.
• Couverture de la longueur complète du gène : Pour les mutations impliquant plusieurs exons ou des gènes entiers, LAA peut couvrir l'ensemble des régions géniques, garantissant qu'aucune mutation clé n'est manquée.
• Processus d'assemblage simplifié : La capacité de lecture longue couvre de plus grandes régions génomiques, réduisant les incompatibilités et les redondances pendant le processus d'assemblage, rendant les résultats d'assemblage précis et fiables.

Quelles sont les applications de l'analyse de longs amplicons ?

• Séquençage complet des gènes 16S/18S/ITS
• Longueur complète Typage HLA
• Haplotypage alternatif
• De nouveau assemblage de gène ciblé
• Personnalisé séquençage d'amplicon

Flux de travail d'analyse des longs amplicons

Spécification de service

	Exigences d'échantillon 2 µg ou plus d'amplicons (c'est-à-dire des produits PCR purifiés) avec une concentration d'environ 50 ng/µl ou plus, doivent être dissous dans un tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8) et expédiés sur des packs de glace sèche. Nous proposons également un service de préparation d'amplicons, à partir de matériaux de départ tels que l'ADN génomique, les pellets cellulaires et les tissus.
	Séquençage Séquençage PacBio plateforme des amorces de 3 kb à plus de 10 kb >99,999 % de précision
	Analyse bioinformatique Pour le séquençage complet des gènes 16S/18S/ITS : Clustering et filtrage des OTUs Analyse des OTUs et annotation des espèces Diversité alpha, diversité bêta, méta-analyse Analyse statistique multivariée Pour d'autres applications, veuillez vous renseigner.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans l'analyse de longs amplicons pour votre rédaction (personnalisation)

Références :

1. Simon Ardui, et al.(2018) Le séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT) arrive à maturité : applications et utilités pour le diagnostic médical. Recherche sur les acides nucléiques. 46(5) 2159–2168.
2. Joshua P. Earl, et al.(2018) Profilage communautaire bactérien au niveau des espèces du microbiome sinonasal sain utilisant le séquençage de Pacific Biosciences des gènes 16S rRNA complets. Microbiome. 6.
3. Henk P.J. Buermans, et al.(2017) Séquençage PacBio d'amplicons longs CYP2D6 flexibles et évolutifs. Mutation humaine. 38(3) 310–316.
4. Frans, Glynis, et al.(2018) Méthode de séquençage conventionnel et à molécule unique ciblée pour la détection de variants spécifiques dans IKBKG tout en contournant le pseudogène IKBKGP1. Le Journal des Diagnostics Moléculaires 20(2) : 195-202.

(Français) et al.., 2018)

1. Quels sont les principaux domaines d'application de l'analyse des longs amplicons ?

L'analyse des longs amplicons trouve une large application dans divers domaines de recherche, qui incluent :

• Études sur les variations structurelles génomiques : elles sont utilisées pour analyser des variations complexes comprenant des insertions, des deletions, des inversions et des séquences répétées significatives.
• Recherche sur les maladies génétiques : Cet outil aide à l'identification de mutations complexes impliquant des régions génomiques allongées associées à un diagnostic clinique.
• Études sur l'évolution et la phylogénie : l'analyse des longs amplicons permet d'explorer les variations génétiques entre les espèces, éclairant ainsi les relations évolutives.
• Recherche sur la diversité microbienne : Elle est utilisée pour étudier la structure de l'ensemble du génome des communautés microbiennes dans divers échantillons environnementaux.

2. Quel est le flux de travail de base de l'analyse des longs amplicons ?

Les processus fondamentaux qui sous-tendent l'analyse des longs amplicons commencent par l'extraction et le nettoyage de l'ADN. L'opération consiste à isoler de l'ADN de qualité optimale à partir des échantillons fournis. Cela est suivi d'un processus d'amplification par PCR où des amorces spécifiques sont utilisées en conjonction avec des polymérases à haute fidélité pour intensifier les segments cibles.

Par la suite, le processus de purification de l'amplicon a lieu, au cours duquel l'ADN non amplifié résiduel et les dimères d'amorces sont éliminés. Cela conduit à l'étape de préparation de la bibliothèque et à un contrôle de qualité. Ici, des bibliothèques compatibles avec les plateformes de séquençage sont préparées et un contrôle de qualité rigoureux est effectué pour garantir leur adéquation aux procédures suivantes.

Séquençage à haut débit est la prochaine étape clé qui utilise des plateformes comme PacBio et Oxford Nanopore apte à séquençage à lecture longueAprès l'étape de séquençage, une analyse de données complète est effectuée. Cette analyse comprend le contrôle de qualité, l'alignement, la détection de variants et l'annotation fonctionnelle.

Avant que les données ne soient stockées et mises à disposition pour distribution, il y a une étape importante de validation et de rapport des résultats. Les principales conclusions sont vérifiées expérimentalement et des rapports d'analyse complets sont générés. En tant qu'étape finale, les données sont stockées en toute sécurité dans des bases de données, après quoi elles sont rendues accessibles pour le partage conformément aux exigences de recherche.

3. Quels sont les outils couramment utilisés dans l'analyse des données d'analyse de longs amplicons ?

Les outils utilisés dans l'analyse de données incluent :
Contrôle de la qualité : FastQC, Trimmomatic, Cutadapt.
Alignement et assemblage : BWA, Bowtie2, Minimap2, Canu, Flye.
Détection de variants : GATK, FreeBayes, Manta, LUMPY.
Annotation fonctionnelle : ANNOVAR, SnpEff.

4. Comment garantir l'exactitude et la fiabilité des résultats de l'analyse des longs amplicons ?

Plusieurs protocoles méthodologiques peuvent être mis en place pour renforcer l'exactitude et la fiabilité, tels que :

• Extraction et purification de l'ADN : L'utilisation de kits sophistiqués associée à une exécution méticuleuse des procédures peut faciliter l'extraction et la purification de l'ADN de haute qualité.
• Optimisation des conditions de PCR : Le réglage précis de conditions spécifiques au sein du processus de réaction en chaîne par polymérase (PCR), telles que la température d'annealing et le temps d'extension, peut aider à garantir une amplification efficace des segments.
• Utilisation de polymérases à haute fidélité : L'application de polymérases à haute fidélité joue un rôle important dans la minimisation des risques de divergences d'amplification.
• Contrôle qualité attentif : Des mesures de contrôle qualité strictes doivent être observées à des points critiques lors des phases de séquençage et d'analyse des données.
• Validation expérimentale : Les résultats clés doivent être validés expérimentalement. Cela pourrait impliquer des méthodes telles que Séquençage de Sanger ou PCR quantitative (qPCR).

Définition des allèles de référence des gènes de groupe sanguin par séquençage à lecture longue : preuve de concept dans le ACKR1 Gène codant les antigènes Duffy

Journal : Médecine transfusionnelle et hémothérapie
Facteur d'impact : 2,283
Publié : 11 décembre 2019

Contexte

Dans le domaine en plein essor de la génomique des groupes sanguins, définir et redéfinir les séquences de gènes ou d'allèles de référence pour divers gènes de groupes sanguins représente des objectifs significatifs, tant pour les applications diagnostiques que pour les explorations scientifiques. Étant donné l'émergence de technologies de séquençage innovantes et puissantes, nous avons cherché à étudier la variabilité des trois allèles les plus prominents de ACKR1 - le gène codant pour les antigènes Duffy cliniquement critiques - au niveau du haplotype, en utilisant un séquençage à lecture longue méthodologie.

Méthodes

Résultats

Les auteurs ont obtenu des lectures de séquençage de haute qualité pour les 162 allèles (précision >0,999). Un total de vingt-deux variations nucléotidiques a été identifié, qui sont rapportées dans des bases de données réputées. Ces variations ont défini 19 haplotypes : composés de quatre dans 46. ACKR1*01huit dans 63 ACKR1*02et sept dans 53 ACKR1*02N.01 allèles respectivement.

Fig. 1. Amplification par PCR à longue portée (LR-PCR) de l'ensemble ACKR1 locus génétique.

Tableau 1. ACKR1 variants et haplotypes identifiés par séquençage à longue lecture

Conclusion

En conséquence, un ensemble d'allèles de référence spécifiques a été établi, utilisant la technologie de séquençage de troisième génération, qui offre une exploration approfondie longitudinale des loci génétiques s'étendant sur plusieurs milliers de paires de bases. Cette nouvelle technique complète les techniques de séquençage de deuxième génération ou à lecture courte, s'avérant être d'une importance cruciale pour déchiffrer des allèles nouveaux, rares et nuls.

Référence :

1. Fichou, Y., Fichou, Y., Berlivet, I., Richard, G., et al.Définition des allèles de référence des gènes de groupe sanguin par séquençage à long lecteur : preuve de concept dans le ACKR1 gène codant les antigènes Duffy. Médecine transfusionnelle et hémothérapie, 2020, 47(1) : 23-32.