Service EM-seq

Méthylation de l'ADN est essentiel dans la régulation de l'expression génique, influençant une large gamme de processus biologiques, y compris le développement, le vieillissement et diverses maladies comme le cancer. À mesure que la recherche en génomique progresse, la demande pour des méthodes de détection de la méthylation de l'ADN plus efficaces et précises s'intensifie. EM-seq (séquençage de méthylation enzymatique) émerge comme une nouvelle technologie d'analyse de la méthylation de l'ADN, prenant la tête de l'analyse de méthylation précise avec des avantages de pointe. Elle offre des solutions sans précédent avec une sensibilité accrue, une précision élevée et des exigences minimales en matière d'entrée d'ADN.

Chez CD Genomics, nous exploitons la puissance de la technologie EM-seq pour offrir des services d'analyse de méthylation exceptionnels, vous permettant d'explorer les subtilités de la régulation génique et les mécanismes sous-jacents à diverses maladies. Dans cette page de service complète, nous examinerons les aspects clés de l'EM-seq, ses avantages technologiques, ses domaines d'application et comment nous fournissons un soutien avancé adapté à vos besoins de recherche.

Introduction à la technologie EM-seq

EM-seq est une technologie de séquençage de l'ADN basée sur des enzymes qui distingue entre la cytosine non méthylée (C) et la 5-méthylcytosine (5mC) méthylée en utilisant des méthodes enzymatiques. Contrairement à la méthode traditionnelle de conversion au bisulfite (WGBS), EM-seq utilise une catalyse enzymatique pour convertir les cytosines non méthylées en uracile (U), tout en laissant les cytosines méthylées inchangées. Lors de l'amplification et du séquençage ultérieurs, l'uracile est reconnu comme de la thymine (T). Cette approche permet une détection précise des sites de méthylation.

Comparaison de la conversion enzymatique et de la conversion au bisulfite

La méthode conventionnelle de conversion au bisulfite est efficace pour détecter la méthylation. Cependant, elle nécessite des conditions de réaction sévères qui endommagent souvent l'ADN, limitant son application dans les échantillons d'ADN à faible entrée. EM-seq surmonte ces problèmes en préservant l'intégrité de l'ADN, ce qui lui permet de traiter une plus large gamme d'échantillons, y compris des échantillons d'ADN traces et fragiles tels que l'ADN tumoral circulant (ctDNA).

Principe expérimental

EM-seq offre une solution complète et robuste pour identifier les régions de méthylation dans le génome humain. Lors de la préparation de la bibliothèque, une conversion enzymatique unique est utilisée, causant beaucoup moins de dommages à l'ADN et nécessitant des entrées d'échantillons plus petites, ce qui se traduit par des bibliothèques de meilleure qualité et de meilleures performances. La conception de sondes de méthylation personnalisées de Twist fournit des sondes efficaces et spécialisées pour l'enrichissement ciblé des CpG. Des réactifs d'hybridation optimisés ajoutent de la flexibilité aux délais de travail et améliorent les taux de ciblage.

Le séquençage par méthylation implique des méthodes enzymatiques ou chimiques qui convertissent la cytosine non méthylée en uracile par déamination, tandis que la cytosine méthylée reste intacte. Lors de l'amplification, l'adénine complémentaire s'apparie avec l'uracile sur le brin complémentaire, introduisant la thymine à la position de la cytosine non méthylée d'origine. Le produit final de la séquence est asymétrique, produisant deux molécules d'ADN double brin différentes après conversion. Pour l'ADN méthylé, le processus aboutit à un motif de séquence alternatif, illustrant la distinction entre les régions méthylées et non méthylées dans les séquences d'ADN.

Figure 1. Le séquençage de méthylation implique des méthodes enzymatiques ou chimiques.

Dans la phase initiale de la réaction, la dioxygénase de translocation Ten-Eleven (TET2) joue un rôle crucial dans la transformation des cytosines méthylées telles que la 5-méthylcytosine (5mC) et la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) en 5-carboxycytosine (5caC). Cela est encore renforcé par un agent d'oxydation, la 5-glucosylhydroxyméthylcytosine (5ghmC). Ces réactions servent de mécanismes de protection, protégeant la 5mC et la 5hmC des activités de désamination ultérieures.

Avant la désamination des cytosines en uracile par l'enzyme APOBEC, l'ADN subit une dénaturation pour se préparer à des réactions ultérieures. L'amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) transforme les 5mC ou 5hmC modifiés en cytosine et convertit l'uracile en thymine. Après la PCR, la séquence d'acide nucléique reflète celle des séquences converties par bisulfite, garantissant la compatibilité de l'EM-seq avec les flux de travail analytiques existants, y compris des outils comme Bismark et bwa-meth.

Efficacité de la conversion enzymatique

Avantages de l'EM-seq

La technologie EM-seq surpasse la méthode traditionnelle de conversion au bisulfite dans plusieurs aspects clés, en particulier lorsqu'il s'agit de travailler avec de faibles quantités d'ADN. Voici quelques avantages principaux de la technologie EM-seq :

1. Faible apport en ADN et haute sensibilitéL'un des principaux avantages de l'EM-seq est sa capacité à obtenir des données de séquençage de haute qualité à partir de quantités minimales d'ADN. Contrairement au WGBS, l'EM-seq cause moins de dommages à l'ADN, permettant le séquençage avec aussi peu que 10 ng d'ADN. Cette caractéristique est inestimable pour l'analyse d'échantillons rares ou précieux, tels que l'ADN tumoral circulant (ctDNA) dans le plasma, qui sont généralement faibles en concentration et en poids moléculaire.

2. Fragments de bibliothèque plus longs et plus completsComparé à WGBS, l'EM-seq génère des fragments d'ADN plus longs et plus intacts, minimisant ainsi les lacunes de séquençage. Cela augmente l'exhaustivité des informations de méthylation à l'échelle du génome, en particulier dans les régions difficiles à séquencer, en réduisant efficacement les zones d'ombre de séquençage causées par de courts fragments d'ADN.

3. Uniformité de couverture GC supérieureLes régions de l'ADN riches en contenu GC posent souvent des défis en matière de séquençage en raison des biais potentiels qui peuvent affecter l'exactitude. L'EM-seq excelle dans ce domaine, garantissant une couverture uniforme à la fois dans les zones riches en GC et celles riches en AT, évitant ainsi le biais de couverture GC courant dans le WGBS. Cette caractéristique est cruciale pour analyser avec précision les états de méthylation à travers tout le génome.

4. Détection plus précise des îlots CpGLa méthode EM-seq est particulièrement efficace pour détecter les îlots CpG. À des profondeurs de séquençage équivalentes, l'EM-seq peut révéler davantage de sites CpG, dont beaucoup pourraient être manqués par les méthodes traditionnelles de WGBS. Cette capacité est particulièrement significative pour le dépistage précoce de maladies telles que le cancer, où les changements de méthylation dans les îlots CpG peuvent servir de marqueurs précoces de la maladie.

Applications de l'EM-seq

Dans le paysage scientifique en rapide évolution d'aujourd'hui, la technologie EM-seq a émergé comme un outil puissant avec des applications étendues dans divers domaines. Sa capacité à détecter des échantillons d'ADN à faible concentration et à étudier les variations de la méthylation de l'ADN la rend particulièrement précieuse. Voici comment l'EM-seq transforme des domaines clés de la recherche et du développement :

• Détection précoce du cancer : dépistage et biopsies liquidesL'EM-seq joue un rôle crucial dans la détection précoce et le suivi continu des maladies en identifiant les marqueurs de méthylation de l'ADNc circulant dans les fluides corporels tels que le plasma et l'urine.
• Plongée dans l'épigénétiqueCette technique aide à découvrir comment la méthylation de l'ADN influence l'expression génique et les processus biologiques, éclairant les variations épigénétiques à travers différents états biologiques.
• Précision dans l'analyse des échantillons de traceQue ce soit des échantillons précieux tels que des ovocytes, des spermatocytes ou des embryons, l'EM-seq fournit des informations sur la méthylation avec une grande précision, même à partir d'échantillons minimes.
• Découverte de biomarqueurs novateursLa séquence EM est essentielle dans la sélection et la validation des marqueurs de méthylation liés à des processus biologiques spécifiques, soutenant les efforts futurs de recherche et de développement.
• Aperçus génomiques et épigénétiques sur les maladiesEn déchiffrant le rôle de la méthylation de l'ADN, l'EM-seq contribue de manière significative à notre compréhension des mécanismes biologiques, offrant des perspectives sur les processus de maladies complexes.
• Amélioration du développement de médicamentsLa technologie est utilisée pour étudier comment les médicaments affectent les motifs de méthylation de l'ADN, offrant des données moléculaires essentielles qui facilitent le dépistage et l'optimisation des produits pharmaceutiques.
• Explorer la biodiversité et l'évolutionL'EM-seq analyse les motifs de méthylation à travers différentes espèces ou populations, aidant à découvrir les changements adaptatifs et les mécanismes génétiques qui les régissent.
• Analyse de la méthylation du site de début de transcriptionIl évalue avec précision l'état de méthylation aux sites de début de transcription (TSS), en particulier dans les régions riches en GC, pour révéler leurs rôles régulateurs dans l'expression génique.

Comparaison des plateformes pour l'analyse de la méthylation de l'ADN

Flux de travail EM-seq

S'engager avec nos services offre une expérience fluide conçue pour fournir des résultats de haute qualité pour vos projets EM-seq. Voici comment nous garantissons l'excellence à chaque étape :

Étape 1 : Extraction de l'ADNNous commençons par extraire méticuleusement de l'ADN génomique de haute qualité à partir de vos échantillons. Cette première étape cruciale garantit que l'ADN est intact et exempt de tout contaminant, établissant ainsi une base solide pour des analyses ultérieures.

Étape 2 : Préparation de la bibliothèqueEn utilisant des technologies de préparation de bibliothèque à la pointe, nous préparons habilement vos échantillons d'ADN pour le séquençage EM-seq. Ce processus est crucial pour garantir que vos échantillons sont idéalement préparés pour des résultats précis.

Étape 3 : SéquençageVotre bibliothèque d'ADN est ensuite séquencée en utilisant les dernières technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS). Cette phase nous permet de capturer des données de méthylation à l'échelle du génome, offrant une vue d'ensemble étendue du paysage épigénétique.

Étape 4 : Analyse des donnéesNotre équipe d'experts en bioinformatique élabore pour vous un rapport d'analyse de données détaillé. Ce rapport comprend les niveaux de méthylation, l'identification des régions méthylées de manière différentielle et la détection des îlots CpG, vous permettant d'extraire des informations exploitables de vos données.

Figure 1. Le séquençage de méthylation implique des méthodes enzymatiques ou chimiques.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon Types d'échantillons : tissus, cellules et fluides corporels de patients atteints de cancer. Parmi les échantillons de fluides corporels, le plasma est recommandé plutôt que le sérum afin de minimiser l'interférence de l'ADNc dérivé des lymphocytes. Volume d'échantillon : Tissu > 50 mg ; cellules > 2×106; plasma > 5 mL, sérum > 10 mL. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Plateforme : Plates-formes de séquençage à haut débit telles que la série Illumina HiSeq. Profondeur de couverture : ≥ 30x. Score de qualité : Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : 1. Statistiques d'alignement du génome 2. Évaluation du niveau de méthylation global 2.1 Distribution du niveau de méthylation des CpG 2.2 Couverture de la méthylation des CpG 3. Statistiques des sites de méthylation et comparaison inter-échantillons 3.1 Analyse de la Corrélation du Niveau de Méthylation 3.2 Analyse en Composantes Principales (ACP) des Niveaux de Méthylation 3.3 Analyse de cluster des niveaux de méthylation 4. Analyse des sites de méthylation différentielle 4.1 Annotation des sites de méthylation différentielle 4.2 Visualisation des sites de méthylation différentielle 4.3 Analyse d'enrichissement des sites de méthylation différentielle 5. Analyse des régions de méthylation différentielle 5.1 Annotation des sites de méthylation différentielle 5.2 Visualisation des sites de méthylation différentielle 5.3 Analyse d'enrichissement des sites de méthylation différentielle Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Profilage de méthylation détaillé

EM-seq, en tant que technologie révolutionnaire de séquençage de la méthylation de l'ADN, surpasse la méthode traditionnelle de conversion au bisulfite grâce à ses avantages en matière de faible quantité d'ADN, de haute sensibilité et de couverture GC uniforme, fournissant des données de méthylation de meilleure qualité et plus précises pour divers domaines de recherche. Chez CD Genomics, nous nous engageons à offrir à nos clients les services EM-seq les plus avancés pour vous aider dans l'exploration approfondie de la régulation des gènes, des mécanismes de la maladie, de la recherche sur le cancer et d'autres domaines.

Que vous meniez des recherches fondamentales ou développiez des outils de diagnostic avancés, les services EM-seq peuvent offrir un excellent soutien à votre recherche. N'hésitez pas à nous contacter pour en savoir plus sur EM-seq ou demander un devis, et laissez cette technologie avancée vous aider à réaliser de nouvelles avancées scientifiques.

Résultats de la démonstration

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Histogramme de distribution de la méthylation CpG

Histogramme de couverture CpG

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique en volcan des sites différemment méthylés

Carte thermique des sites méthylés différemment

Analyse d'enrichissement KEGG des régions différemment méthylées

FAQ sur l'EM-seq

Quelles sont les points à noter lors de l'extraction de l'ADNg ou de l'ADNcf ?

Lors de l'extraction d'ADN génomique (gDNA) ou d'ADN libre de cellules (cfDNA), il est recommandé d'atteindre les éléments suivants :

• Exigence en ADN génomique: Total ≥20 ng, Concentration ≥2 ng/μl
• Exigence en cfDNATotal ≥20 ng, Concentration ≥2 ng/μl

De plus, il est crucial d'éviter d'utiliser l'EDTA ou l'EB comme solvants pour votre gDNA/cfDNA extrait, car ces composants peuvent nuire à l'efficacité enzymatique.

Quelles précautions doivent être prises lors de la séparation du sérum ou du plasma ?

Lors de la séparation du sérum ou du plasma :

• Évitez le gel-dégelLes échantillons de sang total ne doivent pas subir de cycles de congélation-dégel.
• Traitement rapidePréparez le plasma ou le sérum dès que possible après la collecte de sang.
• Conditions de stockageLe sérum ou le plasma peut être conservé à -80°C pour maintenir son intégrité. Les cycles de congélation-dégel répétés doivent être évités pour préserver la qualité de l'échantillon.

Comment le taux de conversion des échantillons est-il calculé ?

Lors de la préparation de la bibliothèque de méthylation, la conversion théorique suppose que tous les cytosines non méthylés (C) sont convertis en thymines (T) (initialement convertis en uracile (U), puis en T lors de la PCR). Cependant, tous les sites ne peuvent pas se convertir, et l'état de méthylation de l'ADN est initialement inconnu. Par conséquent, les taux de conversion réels ne peuvent pas être déterminés directement à partir de l'ADN de l'échantillon.

Pour y remédier, l'ADN lambda (ADN de bactériophage), qui ne contient que des cytosines non méthylées, est utilisé comme contrôle négatif avec un statut de méthylation connu. En incorporant l'ADN lambda dans la préparation de la bibliothèque, le traitement et le séquençage aux côtés de l'ADN de l'échantillon, le taux de conversion de l'ADN lambda est calculé pour servir d'indicateur du taux de conversion global de l'échantillon.

Études de cas EM-seq

Analyse de séquençage épigénétique multimodal (MESA) de l'ADN libre circulant pour la détection non invasive du cancer

Journal : Médecine Génomique
Facteur d'impact : 7,324
Publié : 16 janvier 2024

Contexte

La méthylation de l'ADN libre de cellules (cfDNA) a émergé comme un biomarqueur prometteur pour la détection précoce du cancer, surmontant les limitations des approches basées sur les altérations génétiques. Le séquençage de méthylation enzymatique (EM-seq) améliore le séquençage traditionnel au bisulfite en préservant l'intégrité de l'ADN, permettant une analyse épigénétique multimodale qui améliore la précision de la détection du cancer.

Matériaux et Méthodes

Résultats

MESA (Analyse de Séquençage Épigénétique Multimodale) a démontré de solides performances dans la détection du cancer colorectal en intégrant plusieurs caractéristiques épigénétiques provenant de l'ADNcf. Les principales conclusions incluent :

1. Analyse de la méthylation:

• La méthylation de l'ADNcf seule a distingué les échantillons de cancer des échantillons non cancéreux avec une grande précision (AUC = 0,8663 pour la cohorte 1 et AUC = 0,8293 pour la cohorte 2).
• Les échantillons de cancer ont montré des niveaux de méthylation plus élevés aux sites CpG cibles, ce qui est cohérent avec l'hyperméthylation des promoteurs dans les tumeurs.

La méthylation différentielle de l'ADNcf entre les échantillons cancéreux et non cancéreux permet une détection précise du cancer.

2. Aperçus sur l'organisation des nucléosomes:

• MESA a efficacement capturé l'occupation des nucléosomes et leur flou, révélant des différences structurelles clés entre les échantillons cancéreux et normaux.
• Les sites de polyadénylation ont été inclus dans l'analyse pour la première fois, fournissant de nouvelles perspectives sur l'organisation de la chromatine liée au cancer.

Informations sur l'organisation des nucléosomes à partir de l'EM-seq ciblé de l'ADNcf.

3. Détection du cancer à l'aide des caractéristiques des nucléosomes:

• L'occupation des nucléosomes seule a atteint des AUC de 0,8494 (cohorte 1) et 0,9213 (cohorte 2).
• L'inclusion des données sur les sites de polyadénylation a encore amélioré la précision de détection du cancer.
• La flou des nucléosomes, une nouvelle métrique capturant l'hétérogénéité de la chromatine, a fourni un pouvoir prédictif supplémentaire.

4. Intégration multimodale pour une précision améliorée:

• La combinaison de la méthylation, de l'occupation des nucléosomes, de la flou et du WPS a amélioré les performances de classification.
• Le modèle multimodal a systématiquement surpassé les modèles à caractéristiques uniques à travers différents stades de cancer et cohortes.

Détection précise du cancer basée sur l'occupation des nucléosomes et la flou.

5. Validation inter-cohortes:

• MESA était robuste à travers différentes cohortes, maintenant une haute précision prédictive.
• L'approche était adaptable à d'autres méthodes de séquençage sans bisulfite (par exemple, cfDNA TAPS) et s'est révélée efficace pour détecter les cancers hépatocellulaires et pancréatiques.

Conclusion

MESA intègre plusieurs modalités épigénétiques, améliorant la précision de détection des cancers colorectal, hépatique et pancréatique, validée à travers quatre cohortes. Cela représente une avancée majeure dans la détection non invasive du cancer en s'appuyant sur des profils épigénétiques complets de cfDNA.

Référence:

1. Li, Y., Xu, J., Chen, C. et al.Analyse épigénétique multimodale par séquençage (MESA) de l'ADN libre circulant pour la détection non invasive du cancer colorectal. Médecine du génome 16, 9 (2024). Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder ou traduire le contenu d'un lien. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici.