RIP-Seq

CD Genomics propose des services avancés de RIP-seq utilisant séquençage de nouvelle génération (NGS)  technologie. Notre service RIP-seq fournit une analyse précise et complète des interactions ARN-protéine, offrant des informations détaillées sur les interactions des protéines liant l'ARN à travers divers échantillons biologiques.

Introduction au RIP-Seq

Chaque activité du cycle de vie des transcrits, de la naissance (polymérases) à la dégradation (nucléases), implique la liaison de protéines. En plus de la production de protéines, un sous-ensemble de ces transcrits joue des rôles cruciaux dans d'autres processus essentiels tels que la régulation épigénétique et la protection du génome par le silençage des transposons. La plupart des études se sont concentrées sur le profilage transcriptomique. Cependant, on pense que les niveaux d'ARNm ne corrèlent pas toujours directement avec les niveaux de protéines à l'état d'équilibre. L'intérêt pour l'identification des ARN associés aux protéines liantes d'ARN (RBP) dans un contexte cellulaire est en croissance, car le rôle du traitement de l'ARN et des événements de traduction qui se produisent post-transcriptionnellement commence à être apprécié.

La RIP-Seq cartographie les sites où les protéines sont liées à l'ARN au sein des complexes ARN-protéine. L'immunoprécipitation par ARN (RIP) implique la purification des interactions ARN-protéine dans des conditions natives en utilisant un anticorps spécifique à la protéine pour cartographier le RBP d'intérêt. L'avènement des technologies de séquençage, associé à diverses chimies RIP, a permis la détection simultanée de milliers de transcrits liés (ARNm, ARN non codants ou ARN viraux) dans une seule expérience. La génomique CD fournit un séquençage d'ARN RIPé pour obtenir des aperçus non seulement sur des processus bien établis tels que la transcription, l'épissage et la traduction, mais aussi dans des domaines plus récents tels que l'interférence par ARN et la régulation génique par des ARN non codants.

Avantages de notre service RIP-Seq

• Dans la recherche biologique actuelle, le RIP-seq se distingue comme la méthode la plus efficace pour déterminer les interactions protéine-ARN dans l'état naturel d'une cellule. Cette technique identifie efficacement si une protéine est une protéine liant l'ARN, élucide quels ARN interagissent directement avec la protéine et localise leurs sites de liaison.
• Le RIP-seq permet l'investigation complète des interactions protéine-ARN au niveau de l'ensemble du transcriptome, éclairant les types d'ARN impliqués dans ces interactions.
• Avec sa haute résolution, le RIP-seq offre la possibilité de discerner les séquences d'ARN qui interagissent avec les protéines, fournissant ainsi des informations précieuses sur le paysage complexe des interactions protéine-ARN.
• Rapport coût-efficacité : Le cycle expérimental est court, l'analyse est complète et le prix est bas.
• Haute couverture : L'ensemble du transcriptome est couvert, permettant le dépistage et l'identification des sites de liaison des protéines à travers tout le transcriptome.
• Haute sensibilité : Des millions de séquences d'étiquettes peuvent être obtenues à partir de chaque échantillon, permettant la découverte de sites de liaison de protéines rares sur le transcriptome.
• Haute Précision : Des données avec un rapport signal/bruit élevé peuvent être obtenues, distinguant avec précision les événements réels du bruit et localisant précisément les sites de liaison des protéines.
• Plan de séquençage par immunoprécipitation d'ARN personnalisé : Des plans de séquençage par immunoprécipitation d'ARN sur mesure peuvent être conçus en fonction des besoins spécifiques.

Applications du RIP-Seq 

• Étudier les interactions entre l'ARN et les protéines au sein des cellules
• Identification des interactions entre les protéines liant l'ARN (RBP) et les ARN non codants (tels que les LncARN, les miARN, etc.)
• Cartographie des interactions à l'échelle du génome entre l'ARN et les RBP

Flux de travail RIP-Seq

CD Genomics applique l'Illumina NGS équipement pour séquencer les transcrits liés, révélant les interactions à l'échelle du génome des RBP. Les chercheurs soumettront l'ARN extrait par les méthodes de RIP appropriées basées sur l'immunoprécipitation de protéines spécifiques à partir de lignées cellulaires ou de tissus. Notre service RIP-Seq, offrant le flux de travail de l'assurance qualité des échantillons à l'analyse des données, permet un profilage rapide et une compréhension approfondie de l'ARN.

Fig2. Flux de travail RIP-Seq

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon ARN IPed ≥ 100 ng, Quantité minimale : 40 ng, Concentration ≥ 5 ng/µL Cellule ≥ 5×107 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 200 mg OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Les options de service flexibles incluent HiSeq X et NextSeq 500 Profondeur de séquençage : 6-12G
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle qualité des données brutes Alignement et quantification basée sur TPM/RPKM/FPKM Analyse d'expression Analyse du splicing alternatif Annotation GO et KEGG Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans le RIP-Seq pour votre rédaction (personnalisation)

Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Référence

1. Zhao J et al.Identification à l'échelle du génome des ARN associés aux polycomb par RIP-seq. Cellule Moléculaire, 22 déc. 2010 ; 40(6) : 939-53

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

1. Quelles sont les récentes avancées dans le séquençage RIP ?

Les récentes avancées dans le RIP-seq ont évolué de manière significative. Ces développements comprennent des améliorations dans l'ingénierie des anticorps axées sur la spécificité, des techniques de réticulation raffinées aidant à une meilleure isolation des complexes ARN-protéines, et l'introduction de ressources bioinformatiques sophistiquées pour l'interprétation des données. De plus, l'intégration du RIP-seq avec des méthodologies telles que le CLIP-seq (séquençage par réticulation et immunoprécipitation) offre des perspectives supplémentaires sur les interactions ARN-protéines.

2. Comment peut-on garantir le succès des expériences de RIP-seq ?

Validation des anticorps : Utilisez des anticorps bien caractérisés et de haute affinité.

Méthodes optimisées : Respectez les procédures optimisées pour la lyse cellulaire, l'immunoprécipitation et l'extraction d'ARN.

Contrôles appropriés : Intégrez des contrôles appropriés (tels que des contrôles IgG non spécifiques, de l'ARN d'entrée) pour discerner les interactions spécifiques des signaux de fond.

Répétition : Réalisez des répliques biologiques pour confirmer la reproductibilité des résultats.

Intégrité des données : Utilisez des plateformes de séquençage de haute qualité et une approche approfondie. bioinformatique analyses pour maintenir l'exactitude et la fiabilité des données.

3. Qu'est-ce que l'entrée et quel est son rôle dans les expériences ?

Suite à la fragmentation de l'ARN, avant l'immunoprécipitation, une partie de l'échantillon doit être mise de côté en tant que contrôle d'entrée (non soumise à l'immunoprécipitation). Le contrôle d'entrée se compose de l'ARN fragmenté, qui, avec l'ARN de l'échantillon immunoprécipité, subit un désamorçage des liaisons croisées, une purification de l'ARN et des méthodes de détection ultérieures telles que la PCR. Grâce à l'analyse des données ultérieures, le contrôle d'entrée permet d'exclure le bruit de fond (pics faussement positifs causés par des liaisons non spécifiques), valide l'efficacité de la fragmentation de l'ARN et confirme l'efficacité de l'IP tout au long de l'expérience. Par conséquent, le contrôle d'entrée est une étape indispensable dans les expériences IP-seq.

RIP-Seq de EZH2 identifie TCONS-00036665 en tant que régulateur de la myogenèse chez les porcs

Journal : Frontières en biologie cellulaire et développementale

Facteur d'impact : 6,081

Publié : 12 janvier 2021

Contexte

La myogenèse du muscle squelettique des vertébrés implique des cellules progénitrices régulées par Pax3 et Pax7, qui induisent Myf5 et MyoD pour la différenciation musculaire. Les cellules satellites aident à la régénération. EZH2, une protéine Polycomb, est cruciale pour le développement musculaire et la régulation des gènes via la méthylation des histones. lncARNs interagir avec EZH2 pour réguler la myogenèse. Cette étude a utilisé le RIP-Seq combiné au séquençage de lincRNA (lincRNAseq) pour identifier 356 nouveaux lincRNA dans le muscle squelettique porcin, révélant des informations sur leurs rôles, tels que TCONS-00036665, qui favorise la prolifération des cellules satellites mais inhibe la différenciation, influençant ainsi le développement musculaire.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans cette étude, le RIP-Seq a identifié des lincARNs liant EZH2 dans le muscle squelettique de porcs âgés d'un mois. En utilisant un enrichissement d'anticorps EZH2 validé par Western blot, les auteurs ont réalisé des expériences de RIP-Seq et de lincRNAseq. Des étapes de filtrage basées sur les niveaux d'expression et les valeurs CPC ont permis d'identifier 356 lincARNs liant EZH2, principalement situés dans des régions intergéniques, suggérant leurs rôles régulateurs dans la biologie musculaire.

Figure 1. L'identification de nouveaux lincARNs liant EZH2.

Figure 2. La vérification des nouveaux lincARNs liant EZH2.

Trois lincRNAs, TCONS-00025364, TCONS-00045380 et TCONS-00036665, ont été confirmés comme se liant à EZH2 par des expériences de RIP-PCR (Figure 2C). TCONS-00036665, aligné avec le transcript EF397601 du porc, partage des similitudes avec le gène NEAT1 humain et murin, suggérant son implication dans le développement des muscles squelettiques. Une caractérisation supplémentaire a révélé que TCONS-00036665 est un transcript polyadénylé de 3 450 pb, principalement localisé dans les noyaux des cellules satellites musculaires porcines (PSCs) en prolifération et différenciées. L'analyse d'expression a indiqué que TCONS-00036665 augmente pendant la différenciation des PSC, suggérant son rôle dans la régulation des processus de prolifération et de différenciation.

Figure 3. La caractérisation moléculaire de TCONS-00036665.

Figure 4. La réduction de TCONS-00036665 inhibe la prolifération des PSC mais favorise la différenciation des PSC.

Figure 5. La surexpression de TCONS-00036665 favorise la prolifération des PSC mais inhibe la différenciation des PSC.

Conclusion

Dans cette étude, la répression génique médiée par EZH2 dans le muscle squelettique porcin a été examinée. TCONS-00036665, un lincRNA se liant à EZH2, a été identifié et s'est avéré réguler la prolifération et la différenciation des cellules satellites musculaires en augmentant l'enrichissement de H3K27me3 médié par EZH2 sur les promoteurs des gènes cibles. Les résultats suggèrent un nouveau rôle régulateur pour les lincRNAs dans le développement musculaire porcin à travers des mécanismes épigénétiques impliquant EZH2.

Référence

1. Wang S, Xu X, Liu Y, et al. RIP-Seq de EZH2 identifie TCONS-00036665 en tant que régulateur de la myogenèse chez les porcs. Frontières en biologie cellulaire et développementale, 2021, 8 : 618617.