RNA-Seq

CD Genomics fournit des services de séquençage d'ARN (RNA-Seq) précis et abordables depuis des décennies. Nous combinons à la fois Illumina (et) PacBio plateformes de longues lectures pour obtenir le transcriptome qui permet l'assemblage de novo ou le re-séquencement pour bactéries, plantes, animaux et humains.

Qu'est-ce que le séquençage d'ARN ?

L'ARN-Seq, un outil essentiel utilisant Séquençage de nouvelle génération (NGS) technologies, est conçu pour créer des cartes détaillées et des quantifications des transcriptome, dévoilant ainsi des informations telles que les niveaux de transcription des gènes, la structure et l'expression des transcrits, la modification de l'ARN et l'ARN non codant, parmi d'autres aspects. Le transcriptome, une collection complète de tous les transcrits dans une cellule, offre des informations vitales concernant les niveaux de transcrits à des stades de développement ou des états physiologiques spécifiques. Comprendre le transcriptome est essentiel pour interpréter les éléments fonctionnels du génome, ainsi que pour comprendre le développement biologique et les maladies. Les objectifs clés de la transcriptomique comprennent le catalogage de toutes les espèces de transcrits ; la détermination de la structure transcriptionnelle des gènes ; et la quantification des niveaux d'expression de chaque transcrit dans des conditions variées.

En offrant une vue impartiale et haute résolution des modèles de transcription globaux, l'RNA-Seq introduit une méthode économique et précise pour la quantification de l'expression génique et l'analyse de l'expression génique différentielle à travers plusieurs groupes d'échantillons. Il permet l'identification de nouveaux transcrits et de transcrits précédemment non prédits, indépendamment d'un génome de référence, facilitant ainsi l'assemblage de novo de transcriptomes non étudiés. De plus, il permet la découverte de nouvelles architectures géniques, d'isoformes alternativement épissées, de fusions géniques, de SNP/InDel et d'expressions spécifiques d'allèles (ASE).

Avantages de l'ARN-Seq

• Mesures quantitatives et précises des molécules d'ARN à une résolution d'un seul paire de bases.
• Découverte de nouveaux transcrits, variantes d'épissage et fusions géniques.
• Remarquablement, cette stratégie est applicable à n'importe quelle espèce, indépendamment de la disponibilité du génome de référence.
• Une pratique offrant des coûts comparables, voire inférieurs, par rapport à de nombreuses autres méthodologies.
• L'approche détecte habilement divers types d'ARN, couvrant ARNm, miARN, lncARN, entre autres, offrant un point de vue complet sur l'ARN présent dans les cellules ou les tissus.
• Il convient de noter la capacité d'analyser simultanément plusieurs échantillons, accumulant efficacement une grande quantité de données - une caractéristique soulignant son utilité profonde dans l'analyse RNA à haut débit.

Développement de l'ARN-Seq

La technologie de séquençage a subi d'importantes transformations et avancées au fil du temps, en particulier au cours des deux à trois dernières décennies. Au départ, Séquençage de Sanger a été institué comme la méthode de séquençage de première génération. En exploitant les réactions de synthèse par terminaison réversible en chimie binaire, le séquençage de Sanger a permis de déterminer les séquences de bases aux extrémités de l'ADN conformément à la séquence d'ARN. Les années 1990 ont marqué des avancées notables dans la technologie de séquençage coïncidant avec le début des projets de séquençage du génome entier. Introduction de séquençage à haut débit plateformes, telles que le séquençage 454, Séquençage Illumina, et le séquençage Ion Torrent, ont facilité la faisabilité du séquençage de l'ARN. Les technologies de séquençage de l'ARN traditionnelles nécessitaient souvent un volume substantiel de cellules pour obtenir une quantité satisfaisante d'ARN pour le séquençage, ce qui masquait l'hétérogénéité entre les différentes cellules. En essence, ces techniques révèlent les caractéristiques d'expression génique de types et d'états cellulaires distincts.

Les applications de l'ARN-Seq

Le séquençage de l'ARN (RNA-seq) est une technique largement utilisée, applicable dans divers domaines de la recherche biologique et médicale. Voici plusieurs applications courantes du RNA-seq :

• Analyse de l'expression génique
• Analyse de l'expression génique différentielle
• Découverte de nouveaux gènes
• Analyse du splicing alternatif
• Biomarqueur découverte
• Recherche sur les ARN non codants
• Élucidation de la fonction des gènes
• Génétique des populations et biologie évolutive

En effet, avec les avancées technologiques, le champ des applications de l'ARN-seq continue de s'élargir sans cesse.

Flux de travail RNA-Seq

CD Genomics combine à la fois Illumina HiSeq et Systèmes PacBio fournir une analyse RNA-Seq et bioinformatique rapide et précise pour n'importe quelle espèce. Notre équipe d'experts hautement expérimentés met en œuvre une gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux. Le flux de travail général pour RNA-Seq est décrit ci-dessous.

Spécification de service

	Exigences et préparation des échantillons Quantité d'ARN ≥ 2 μg, concentration d'ARN ≥ 50 ng/μl, OD260/280=1,8~2,0 Tous les échantillons d'ARN sont validés pour leur pureté et leur quantité.
Cliquez	Séquençage Illumina HiSeq PE150 Étude d'expression génique différentielle : Illumina HiSeq 50 Transcription intégrale : PacBio SMRT Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse bioinformatique Nous proposons des analyses bioinformatiques personnalisées, y compris : Statistiques de profondeur de séquençage et de couverture Assemblage de novo et cartographie du génome de référence Annotations génétiques et niveaux d'expression génique Prédiction de nouveaux ARN et identification de variants Test pour l'expression génique différentielle Évaluation de l'expression spécifique des allèles Identification des loci de traits quantitatifs d'expression (eQTL)

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans l'ARN-Seq pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose un package complet de services de séquençage d'ARN comprenant la standardisation des échantillons, la construction de bibliothèques, le séquençage approfondi, le contrôle de qualité des données brutes, l'assemblage du génome et une analyse bioinformatique personnalisée. Nous pouvons adapter ce pipeline à vos intérêts de recherche. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références :

1. Marguerat S, Bähler J. RNA-seq : de la technologie à la biologie. Sciences de la vie cellulaires et moléculaires, 2010, 67 : 569-579.
2. Hrdlickova R, Toloue M, Tian B. Méthodes RNA-Seq pour l'analyse du transcriptome. Wiley Interdisciplinary Reviews : RNA, 2017, 8(1) : e1364.
3. Saliba A E, Westermann A J, Gorski S A, et al. RNA-seq à cellule unique : avancées et défis futurs. Recherche sur les acides nucléiques, 2014, 42(14) : 8845-8860.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Graphique en volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Combien de répliques biologiques ai-je besoin pour chaque condition ?

Nous vous suggérons de soumettre au moins 3 répliques par échantillon pour augmenter la confiance et réduire l'erreur expérimentale. Notez que cela ne sert que de ligne directrice, et le nombre final de répliques sera déterminé par vous en fonction de vos conditions expérimentales finales.

2. Quels avantages le séquençage de nouvelle génération (NGS) a-t-il par rapport aux microarrays ?

Diverses technologies ont été développées pour l'analyse du transcriptome, telles que microarray et NGS. Par rapport aux microarrays, le NGS présente plusieurs avantages, notamment :

i. L'RNA-Seq est un outil sensible pour le profilage de l'expression génique. Par rapport aux microarrays, l'RNA-Seq offre une lecture numérique qui est plus précise pour l'expression de tous les gènes.

ii. Les microarrays ne peuvent offrir qu'une information limitée sur l'expression des gènes (c'est-à-dire les gènes intégrés dans la puce), tandis que le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une approche plus complète qui fournit des informations supplémentaires sur les variantes génétiques nouvelles et les transcrits de faible abondance.

iii. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) produit des résultats beaucoup plus reproductibles et fiables que les microarrays. Il n'est pas nécessaire de réaliser une qPCR après un RNA-Seq, alors que c'est une procédure standard pour microarray pour vérifier les résultats.

3. Quand est-il nécessaire d'éliminer l'ARNr avant le séquençage ?

L'ARN ribosomique (ARNr) constitue plus de 90 % de l'ARN total. Réaliser un séquençage d'ARN (RNA-Seq) sans enrichir pour l'ARN poly-A ou dépléter l'ARNr produira principalement des lectures provenant de l'ARNr. Par exemple, moins d'un dixième des lectures contiendrait des informations utiles. Les transcrits provenant de transcriptomes dépourvus d'ARNr sont traditionnellement considérés comme de l'ARN total, englobant ARNm et ARN non codants. Par conséquent, l'enrichissement en poly-A ou la déplétion de l'ARNr est essentiel pour toute plateforme de séquençage.

4. Quel est le pipeline conventionnel pour l'analyse des données RNA-Seq ?

Le pipeline conventionnel pour les données RNA-Seq comprend le contrôle de qualité des données brutes, l'alignement, l'assemblage, le profilage de l'expression génique et d'autres analyses.

Figure 1. Aperçu de l'analyse des données RNA-Seq (Kukurba et Montgomery 2015).

La distinction entre Séquençage de l'ADN et le séquençage de l'ARN découle de leurs différentes capacités analytiques. Le séquençage de l'ADN nous permet de comprendre la composition des gènes au sein du génome d'un organisme, de discerner leurs fonctions et d'acquérir une connaissance approfondie des relations intergéniques. En revanche, le séquençage de l'ARN affine notre compréhension des mécanismes biologiques et des changements survenant dans les processus vitaux. Cela est réalisé en étudiant les niveaux d'expression, la diversité et les mécanismes régulateurs.

Le séquençage de l'ARN cible spécifiquement les molécules d'ARN, révélant la structure et la fonction du transcriptome et identifiant les variations dans l'expression génique. Dans ce processus, les molécules d'ARN sont transcrites en leurs homologues d'ADN complémentaire (appelés cDNA) qui sont ensuite séquencés. Les composants courants du séquençage de l'ARN comprennent généralement le séquençage du transcriptome complet, l'analyse de l'expression différentielle, entre autres.

Référence :

1. Kukurba K R, Montgomery S B. Séquençage et analyse de l'ARN. Protocoles de Cold Spring Harbor, 2015(11) : pdb. top084970.

La caractérisation du transcriptome par séquençage d'ARN identifie une subdivision moléculaire et clinique majeure dans la leucémie lymphoïde chronique.

Journal : Recherche sur le génome
Facteur d'impact : 11,92
Publié : en ligne le 21 novembre 2013

Résumé

Les auteurs ont réalisé un séquençage RNA profond dans différentes sous-populations de lymphocytes B normaux et de cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) provenant d'une cohorte de 98 patients. Ils ont détecté des milliers d'éléments transcriptionnels qui étaient exprimés différemment entre les cellules de LLC et les lymphocytes B normaux ou qui présentaient des motifs d'épissage spécifiques à la LLC. Ils ont également identifié une subdivision moléculaire et clinique majeure dans la LLC.

Méthodes

Résultats

1. Le paysage de l'expression génique de la LLC

Les auteurs ont trouvé 1089 gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules B normales et celles de la LLC (Tableau 1). Comme prévu, les gènes les plus exprimés de manière différentielle sont des immunoglobulines en raison de la clonalité des cellules de LLC. Les analyses de voies ont révélé que les gènes impliqués dans les voies métaboliques avaient une expression plus élevée dans la LLC, tandis que les gènes liés au spliceosome, au protéasome et au ribosome étaient considérablement régulés à la baisse dans la LLC.

Tableau 1. Différences d'expression et d'épissage entre les différents groupes analysés.

Figure 1. Paysage transcriptionnel de la LLC. (A) Le potentiel codant des gènes exprimés différemment entre les échantillons de LLC et normaux. (B) Expression normalisée des éléments transposables (ET). (C) Gènes avec des rapports d'épissage spécifiques à la condition. (D) Expression allèle-spécifique des mutations somatiques.

2. Le paysage d'épissage de la LLC

Les auteurs ont identifié 2000 gènes présentant des différences significatives dans les rapports relatifs des isoformes de splicing alternatives entre les cellules CLL et normales, y compris des gènes avec des isoformes alternatives bien connues en tant que biomarqueurs du cancer, tels que RAC1, CD44 et BCL2L1. Des changements dans la voie BCR ont été identifiés au niveau de l'expression et au niveau du splicing (Figure 2).

Figure 2. Changements d'épissage dans la voie BCR entre des échantillons normaux (N) et tumoraux (T).

3. Chimères transcriptionnelles dans la LLC

Les fusions géniques menant à des protéines chimériques constituent un mécanisme important de la carcinogenèse. Les auteurs ont identifié 122 jonctions chimériques présentes exclusivement dans les cellules CLL grâce à une analyse RNA-seq. Ils ont sélectionné deux chimères (la jonction chimérique FCRL2-FCRL3 et la jonction chimérique GAB1-SMARCA5) pour une validation supplémentaire par PCR et séquençage Sanger.

Figure 3. Jonctions chimériques entre FCRL2-FCRL3 et GAB1-SMARCA5.

4. Identification de deux sous-groupes transcriptionnels majeurs de la LLC

Le regroupement hiérarchique des échantillons de RNA-seq basé sur l'expression génique a clairement séparé les cellules normales des échantillons tumoraux (Figure 4A). Le regroupement a révélé deux grands sous-groupes fortement définis au sein des échantillons de CLL, ce qui a été confirmé par l'analyse en composantes principales et la mise à l'échelle multidimensionnelle.

Figure 4. Principaux sous-groupes transcriptionnels de la LLC. (A) Regroupement des échantillons de LLC et normaux. (B) Cluster de consensus. (C) Mise à l'échelle multidimensionnelle des échantillons de LLC et normaux basée sur l'expression génique. (D&E) Graphique du score d'enrichissement.

5. Pertinence clinique des groupes CLL C1 et C2

Les auteurs ont évalué l'impact clinique des groupes CLL C1 et C2. Comparés aux patients C1, les patients C2 avaient une fréquence plus élevée de mutations dans des gènes liés à un mauvais pronostic et étaient plus susceptibles d'être au stade avancé de Binet.

Figure 5. Comportement clinique des sous-groupes C1 et C2.

Conclusion

Nous avons identifié une expression différentielle de milliers d'éléments transcriptionnels entre les CLL et les cellules B normales, englobant des gènes codant des protéines, des ARN non codants et des pseudogènes. De plus, une majorité de gènes présentait des motifs d'épissage spécifiques à la CLL. Grâce à l'analyse de clusters des données de séquençage d'ARN, nous avons discerné deux sous-groupes moléculaires, C1 et C2, étroitement liés aux caractéristiques biologiques cliniques et à la durée du traitement. Des investigations ultérieures ont suggéré que l'activation du récepteur des cellules B (BCR) dans le microenvironnement des ganglions lymphatiques pourrait être l'origine des différences C1/C2.

Référence :

1. Ferreira P G, Jares P, Rico D, et al. La caractérisation du transcriptome par séquençage d'ARN identifie une subdivision moléculaire et clinique majeure dans la leucémie lymphoïde chronique. Recherche génomique, 2014, 24(2) : 212-226.