Services de biologie unicellulaire et spatiale : de la scRNA-Seq à la transcriptomique spatiale pour une analyse cellulaire de précision

Le séquençage d'ARN à cellule unique résout l'expression génique à la résolution de cellule individuelle ; la transcriptomique spatiale cartographie ces motifs d'expression sur l'architecture tissulaire native. Ensemble, ils répondent à la question des types de cellules qui existent, des états qu'elles occupent et de leur localisation. Ce guide couvre la sélection de la plateforme, les compromis de conception expérimentale et comment associer les questions biologiques à la bonne constellation technologique.

Figure 1 : Paysage technologique de la biologie unicellulaire et spatiale — Aperçu des plateformes scRNA-seq, spatiales et multi-omiques

Des moyennes globales à la résolution cellulaire

La limitation centrale du séquençage d'ARN en vrac n'est pas la sensibilité, mais l'averaging. Un échantillon d'ARN-seq en vrac provenant d'une tumeur contient des transcrits de cellules malignes, de cellules T infiltrantes, de fibroblastes stromaux, de cellules endothéliales et de macrophages, chacun exprimant un programme génique fondamentalement différent. La mesure en vrac réduit cette hétérogénéité à une seule moyenne pondérée. L'analyse d'expression différentielle entre la tumeur et le tissu normal adjacent peut identifier des centaines de gènes statistiquement significatifs, mais ne peut pas vous dire si la régulation à la hausse de l'IL6 provient des cellules cancéreuses ou des cellules immunitaires infiltrantes.

Le scRNA-seq résout ce problème en encapsulant des cellules individuelles dans des gouttes à l'échelle des nanolitres, en étiquetant les transcrits de chaque cellule avec un code-barres unique et en les séquençant séparément. Un seul run 10x Genomics Chromium profile de 500 à 20 000 cellules en parallèle, générant une matrice où les lignes représentent des gènes, les colonnes des cellules, et chaque entrée est le nombre de molécules de transcrits détectées (1). Le résultat n'est pas un profil d'expression par échantillon, mais des milliers — chacun étant une fenêtre sur l'état transcriptomique d'une cellule unique.

Les implications pratiques sont profondes. Une étude de séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) sur le cancer du poumon non à petites cellules, qui a profilé 50 000 cellules, a identifié 12 populations immunitaires et stromales distinctes dont les abondances relatives prédisaient le pronostic des patients — une information invisible dans la moyenne globale. Des études sur la réponse aux inhibiteurs de points de contrôle chez les patients atteints de mélanome ont utilisé le séquençage scRNA-seq apparié et le séquençage des récepteurs des cellules T pour distinguer les clones de cellules T réactifs aux tumeurs des témoins immunologiques. La technologie est passée de la preuve de concept à un déploiement routinier dans des études à l'échelle des cohortes.

Figure 2 : Arbre de décision pour la préparation d'échantillons — Sélection du flux de travail pour cellules fraîches, noyaux, cellules fixées et FFPE

Technologie de base scRNA-Seq

Les flux de travail scRNA-seq convergent vers une architecture commune. Une suspension de cellules uniques est chargée sur un instrument de microfluidique où des cellules individuelles sont co-encapsulées avec des billes de gel barcodées dans des gouttelettes d'huile. Chaque bille porte des millions d'oligonucléotides partageant le même code-barres de cellule mais différant par un identifiant moléculaire unique (UMI) aléatoire, permettant le comptage des transcrits avec une précision moléculaire. Dans chaque gouttelette, les cellules sont lysées, l'ARNm est capturé par amorçage poly(dT), et la transcription inverse incorpore le code-barres de cellule et l'UMI dans l'ADNc. Après rupture des gouttelettes et regroupement, l'ADNc barcodé provenant de milliers de cellules est amplifié, fragmenté et séquencé dans une seule bibliothèque.

La plateforme commerciale dominante est la série Chromium de 10x Genomics (1, 5). La chimie GEM-X v4 de la génération actuelle améliore la sensibilité de capture des transcrits par rapport à son prédécesseur, en particulier pour les types de cellules à faible ARN tels que les cellules immunitaires quiescentes et certaines populations neuronales. L'efficacité de capture des cellules est d'environ 50 à 65 pour cent, avec des taux de doublets inférieurs à 0,9 pour cent pour 1 000 cellules récupérées. Un run standard ciblant 5 000 à 10 000 cellules avec 20 000 à 50 000 paires de lectures par cellule fournit un clustering robuste et une expression différentielle pour les principales populations cellulaires présentes à des fréquences supérieures à environ un pour cent.

Plusieurs alternatives occupent des niches importantes. SMART-seq3, une méthode basée sur des plaques, produit une couverture complète des transcrits plutôt que des lectures biaisées à 3' ou 5', capturant les jonctions d'épissage, la diversité des isoformes et les mutations ponctuelles. Elle excelle lorsque le nombre de cellules est limité — des centaines plutôt que des milliers — et que la caractérisation approfondie par cellule est plus importante que les statistiques au niveau de la population. L'approche de codage à barres en pool séparé de Parse Biosciences élimine complètement la microfluidique, utilisant des rondes séquentielles de codage à barres en puits pour étiqueter jusqu'à 100 000 cellules par expérience à un coût par cellule inférieur.

La nouvelle frontière des séquences longues ajoute une autre dimension. Le séquençage PacBio HiFi et Oxford Nanopore fournit désormais une résolution complète des isoformes à la résolution unicellulaire, permettant de résoudre les événements d'épissage alternatif, les transcrits de fusion et l'expression spécifique des allèles. Cette capacité est particulièrement pertinente pour les neurosciences, où l'épissage alternatif génère une diversité transcriptomique étendue, et pour l'oncologie, où les fusions géniques entraînent la tumorigenèse.

Pour les projets de découverte où l'identification des types cellulaires sans biais est l'objectif, scRNA-seq par gouttelettes basé sur 10x Genomics avec la chimie d'expression génique 3' ou 5', il est possible de capturer l'ensemble du paysage transcriptionnel à travers des milliers de cellules en une seule expérience. Lorsque la question cible une population déjà purifiée — un sous-ensemble immunitaire trié, une lignée cultivée avec une perturbation spécifique — RNA-Seq en vrac souvent offre une couverture transcriptomique plus approfondie à un coût par échantillon inférieur, et la valeur marginale de la résolution unicellulaire diminue. À l'extrémité du spectre de résolution, les études sur l'épissage alternatif, les transcrits de fusion ou l'utilisation d'isoformes spécifiques à un allèle combinent de plus en plus capture de cellules uniques avec séquençage à long lecteur sur les plateformes PacBio HiFi, atteignant une résolution des isoformes de pleine longueur que les méthodes à court lecture biaisées par le 3' ne peuvent pas fournir.

Pour un guide détaillé sur la préparation des échantillons et la décision entre scRNA-seq et snRNA-seq, consultez notre guide compagnon sur Séquençage d'ARN à cellule unique et à noyau unique : préparation des échantillons, flux de travail et conception expérimentale pour des tissus congelés et frais.

Figure 3 : Flux de travail scRNA-seq 10x Genomics — De la dissociation des tissus à l'analyse des données

Transcriptomique spatiale

La limitation fondamentale de la scRNA-seq est l'aveuglement spatial. La dissociation des tissus efface toutes les informations sur l'emplacement de chaque cellule — que ce soit un fibroblaste adjacent à un nid tumoral ou dans le stroma distal, que deux cellules immunitaires interagissantes soient en contact physique, ou qu'une population rare soit regroupée dans une sous-région anatomique spécifique. La transcriptomique spatiale aborde ce problème en capturant et en séquençant l'ARNm directement à partir de sections de tissu, préservant les coordonnées bidimensionnelles de chaque transcript.

Le paysage technologique s'étend sur un continuum de résolution. À l'extrémité de basse résolution, le 10x Visium capture des transcrits sur des lames imprimées avec des spots de 55 micromètres, chacun contenant des oligonucléotides de capture barcodés spatialement. Chaque spot contient des transcrits d'environ 1 à 10 cellules. Le flux de travail Visium Fresh Frozen utilise la capture poly(A) et fonctionne avec n'importe quelle espèce — poisson-zèbre, axolotl, espèces végétales et animaux d'élevage — ce qui en fait la plateforme de choix pour la recherche sur les organismes non modèles.

À l'extrémité haute résolution, Visium HD réduit les zones de capture à des compartiments de 2 micromètres grâce à un réseau d'oligonucléotides continu, s'approchant de la résolution unicellulaire. La chimie basée sur des sondes cible environ 18 000 gènes humains ou 20 000 gènes de souris, ce qui la rend adaptée aux cohortes FFPE où l'ARN est dégradé et la capture poly(A) échouerait. Xenium adopte une approche fondamentalement différente en utilisant la FISH à molécule unique avec imagerie cyclique pour détecter des transcrits individuels à une résolution subcellulaire — environ 0,2 micromètre par transcrit — avec des panneaux couvrant jusqu'à 5 000 gènes. Le Stereo-seq occupe une niche unique : des réseaux de nanoballes d'ADN de 220 nanomètres avec une couverture de tout le transcriptome sur des zones de capture allant jusqu'à 13 par 13 centimètres, suffisamment grandes pour des sections sagittales de tout embryon de souris.

Le défi pratique n'est pas de comprendre ce que fait chaque plateforme, mais de choisir parmi elles. La plupart des projets bénéficient d'une stratégie en couches. Utilisez Visium FF ou Stereo-seq pour le mapping du transcriptome entier au niveau de la découverte, puis validez avec Visium HD pour une résolution à l'échelle des cellules uniques ou Xenium pour la localisation subcellulaire.

La stratégie en couches dépend d'un accès impartial à plusieurs instruments. Les chercheurs travaillant avec un fournisseur qui opère Visium Fresh Frozen, Visium HD, Xenium et Stereo-seq sur site peut concevoir des expériences autour de la question biologique plutôt qu'autour du matériel disponible. Cela devient décisif pour les projets englobant à la fois la découverte et la validation : une enquête sur l'ensemble du transcriptome avec Visium FF identifie des régions d'intérêt, Visium HD fournit une résolution à l'échelle unicellulaire au sein de ces régions, et Xenium confirme des transcrits clés à un niveau subcellulaire — le tout à partir de sections successives du même bloc de tissu.

Pour un traitement approfondi de la sélection des méthodes de transcriptomique spatiale et de la compatibilité avec les échantillons FFPE, consultez notre guide compagnon sur 10x Genomics Transcriptomique Spatiale pour les tissus FFPE et congelés : Cartographie de l'expression génique dans le contexte tissulaire.

Figure 4 : Comparaison des plateformes de transcriptomique spatiale — Visium vs. Visium HD vs. Xenium vs. Stereo-seq

Multi-omique à cellule unique

L'expression génique à cellule unique capture une dimension de l'identité cellulaire. Mais l'état fonctionnel d'une cellule T est défini non seulement par les gènes qu'elle transcrit, mais aussi par le récepteur d'antigène qu'elle exprime, le paysage de la chromatine qui détermine quels gènes sont accessibles, et les protéines de surface qui marquent sa lignée et son état d'activation. La multi-omique à cellule unique intègre deux ou plusieurs de ces types de données provenant de la même cellule.

Le test 10x Genomics Single-Cell Multiome ATAC plus Gene Expression mesure simultanément l'accessibilité de la chromatine et le transcriptome à partir du même noyau. Les noyaux isolés sont transposés avec la transposase Tn5, qui insère de manière préférentielle des adaptateurs de séquençage dans les régions de chromatine ouverte, tandis que l'ARNm nucléaire est capturé à l'aide d'une chimie de perles en gel codées par barres. Après le séquençage, chaque code-barres de cellule génère deux types de données liées : un profil d'expression génique et un profil d'accessibilité de la chromatine. Cette lecture jumelée permet une inférence des réseaux régulateurs de gènes impossible avec une seule modalité.

Le profilage du répertoire immunitaire ajoute une autre couche. L'essai d'expression génique 5' capture la région V(D)J des transcrits des récepteurs des cellules T et des cellules B, ainsi que l'ensemble du transcriptome, permettant une analyse couplée du clonotype et de l'état cellulaire. Le transcriptome d'une seule cellule T révèle si elle est activée, épuisée ou régulatrice ; sa séquence TCR identifie quels clones se sont développés en réponse à l'antigène.

CITE-seq (Indexation Cellulaire des Transcriptomes et des Épitopes par séquençage) étend la résolution unicellulaire au niveau des protéines. Les cellules sont teintées avec un panel d'anticorps conjugués à des oligonucleotides avant encapsulation ; chaque anticorps porte un code-barres unique qui est capturé avec l'ARNm de la cellule. Un panel typique de profilage immunitaire comprend 30 à 50 anticorps ciblant des marqueurs de lignée (CD3, CD4, CD8, CD19, CD14), des marqueurs d'activation (CD25, CD69, HLA-DR) et des molécules de point de contrôle (PD-1, TIM-3, LAG-3). La conception du panel doit équilibrer la couverture biologique par rapport au budget de séquençage — chaque anticorps supplémentaire consomme des lectures. Pour un panel de 50 anticorps sur 10 000 cellules, allouez environ 5 000 à 10 000 lectures supplémentaires par cellule pour les tags dérivés des anticorps en plus du budget de lectures transcriptomiques. La titration des anticorps est obligatoire : titrez chaque conjugé d'anticorps individuellement pour déterminer l'indice de coloration qui sépare clairement les populations positives des populations négatives.

Le goulot d'étranglement pratique dans les projets multi-omiques n'est que rarement la génération de données — c'est l'intégration. Appariement de l'accessibilité de la chromatine avec l'expression génique à partir du même noyauou lier le clonotype d'une cellule T à son phénotype transcriptionnel, nécessite des cadres computationnels qui vont au-delà des pipelines d'analyse standard de scRNA-seq. L'analyse des voisins les plus proches pondérés dans Seurat v5 gère deux modalités, mais l'ajout d'une troisième — l'abondance des protéines à partir des tags dérivés d'anticorps CITE-seq, par exemple — introduit des défis de dimensionnalité et de correction de lot qui nécessitent une attention particulière. planification expérimentale en amontConcevoir la stratégie d'intégration computationnelle en parallèle avec le flux de travail expérimental évite le scénario courant où les données multimodales s'accumulent plus rapidement qu'elles ne peuvent être analysées de manière significative.

Pour un traitement plus approfondi du profilage du répertoire immunitaire et de la conception expérimentale de CITE-seq, consultez notre guide compagnon sur Séquençage V(D)J et CITE-Seq à cellule unique : Intégration du profilage du répertoire immunitaire et des multi-omiques à résolution unicellulaire.

Figure 5 : Technologies Multi-Omics à Cellule Unique — Intégration de scRNA-seq, ATAC-seq, V(D)J et CITE-Seq

Décisions de conception expérimentale

Les décisions les plus importantes dans un projet à cellule unique sont prises avant que la première cellule n'entre dans la puce microfluidique. Le nombre de cellules, la profondeur de séquençage, les répliques biologiques et le choix de la plateforme sont quatre variables interdépendantes qui déterminent la puissance statistique, la résolution biologique et le budget.

Combien de cellules ?

La réponse est dictée par votre population d'intérêt la plus rare. Si votre population cible représente environ dix pour cent des cellules d'entrée, capturer 3 000 cellules au total permet de récupérer environ 300 cellules cibles — suffisant pour l'expression différentielle. Si votre cible est à une fréquence d'un pour cent, vous avez besoin d'environ 10 000 à 20 000 cellules pour récupérer 100 à 200 cellules cibles, le minimum pour une comparaison statistique fiable. Pour les populations en dessous de 0,1 pour cent sans enrichissement, vous avez besoin de 50 000 à 100 000 cellules capturées ou plus.

Une évaluation systématique à travers 23 ensembles de données totalisant 3,68 millions de cellules a établi qu'environ 500 cellules par type cellulaire par réplique biologique est le minimum pour une mesure quantitative fiable de l'expression génique. En dessous de ce seuil, le coefficient de variation des estimations d'expression en pseudobulk devient inacceptablement élevé. Si vous ne pouvez pas atteindre 500 cellules pour votre type cellulaire d'intérêt avec un budget donné, envisagez un enrichissement via FACS avant la préparation de la bibliothèque.

Combien de lectures par cellule ?

Pour la classification des types cellulaires, 20 000 à 25 000 paires de lectures par cellule sont suffisantes. Les gènes marqueurs qui définissent les lignées sont fortement exprimés, et un séquençage supplémentaire montre des rendements décroissants en termes de résolution de clustering. Pour l'expression différentielle au sein d'un type cellulaire, 50 000 paires de lectures par cellule fournissent la sensibilité nécessaire pour des changements de fold modérés. Pour la détection de transcrits rares — facteurs de transcription, cytokines, ARN non codants — 50 000 à 100 000 lectures ou plus par cellule peuvent être nécessaires.

La relation critique est le compromis entre le nombre de cellules et la profondeur. Dans le cadre d'un budget de séquençage fixe — disons, 500 millions de paires de lectures — vous pouvez séquencer 20 000 cellules à 25 000 lectures par cellule, ou 5 000 cellules à 100 000 lectures par cellule. Pour les projets d'atlas cellulaire où la découverte de populations est l'objectif, allouez le budget au nombre de cellules. Pour les études mécanistiques où les populations sont déjà identifiées et où une caractérisation transcriptionnelle approfondie est nécessaire, allouez le budget à la profondeur par cellule. Des cadres d'analyse de puissance tels que scPower modélisent l'interaction entre la taille de l'échantillon, le nombre de cellules par échantillon et la profondeur de séquençage pour guider ces décisions (2).

Figure 6 : Cadre de décision pour la conception expérimentale — Matrice de compromis entre le nombre de cellules, la profondeur de séquençage et les réplicats

Réplicats biologiques — L'incontournable

La leçon statistique la plus importante de la première décennie du scRNA-seq est que les cellules individuelles ne peuvent pas être considérées comme des répliques indépendantes. Les tests d'expression différentielle qui comparent des cellules individuelles entre les conditions traitent chaque cellule comme une observation indépendante. Cependant, les cellules d'un même échantillon biologique partagent un fond génétique, une histoire environnementale et un lot de traitement technique. Les traiter comme indépendantes gonfle la taille effective de l'échantillon et produit des taux de faux positifs de 30 à 80 pour cent (3).

La solution est le pseudobulk. Pour chaque type de cellule au sein de chaque réplique biologique, agrégez les comptes de transcrits à travers toutes les cellules pour produire un seul profil d'expression pseudobulk. Ensuite, appliquez des outils d'expression différentielle standard tels que DESeq2, edgeR ou limma-voom. Cette approche modélise la variation au bon niveau — entre les répliques biologiques, et non entre les cellules individuelles — et réduit les taux de faux positifs au niveau nominal de 5 pour cent. Les revues et les examinateurs exigent de plus en plus une analyse basée sur le pseudobulk pour les revendications d'expression différentielle.

Combien de répliques biologiques ? Pour une comparaison cas-témoin typique avec une taille d'effet modérée — un changement de deux fois dans 10 % des gènes au sein d'un type cellulaire — trois à cinq répliques biologiques par groupe, chacune avec 500 cellules ou plus du type cellulaire cible, offrent une puissance adéquate. Des expériences pilotes sont fortement recommandées : profiler d'abord deux à trois échantillons pour déterminer les fréquences des types cellulaires et confirmer le flux de travail de préparation des échantillons avant de s'engager avec l'ensemble de la cohorte.

Pour un guide détaillé sur l'estimation du nombre de cellules, la planification de la réplication et l'optimisation du budget, consultez notre guide compagnon sur Conception expérimentale pour les études sur les cellules uniques : nombre de cellules, réplicats, profondeur de séquençage et planification des coûts.

Flux de travail des services CD Genomics

Un projet de biologie unicellulaire ou spatiale couvre la préparation des échantillons, la construction de bibliothèques, le séquençage et l'analyse des données. Le flux de travail de CD Genomics saisit les points de décision clés où la consultation technique apporte le plus de valeur.

Figure 7 : Flux de travail du service de biologie unicellulaire et spatiale de CD Genomics — De l'échantillon au rapport

Le processus commence par une consultation de projet abordant les questions de conception ci-dessus : nombre de cellules, profondeur, réplicats et sélection de la plateforme. La préparation des échantillons est la phase la plus sensible aux techniques. Les tissus frais doivent être traités en une suspension de cellules uniques viables dans une fenêtre étroite après la collecte ; les protocoles de dissociation enzymatique sont spécifiques au tissu et doivent équilibrer le rendement cellulaire avec les réponses au stress transcriptionnel. Pour les échantillons où des cellules intactes ne peuvent pas être obtenues — tissus congelés, spécimens cérébraux riches en lipides, blocs FFPE archivés — flux de travail basés sur des noyaux contourner entièrement la dissociation cellulaire, en capturant les transcrits nucléaires à partir d'échantillons congelés et archivés qui seraient incompatibles avec le séquençage d'ARN unicellulaire à partir de cellules entières.

La préparation de la bibliothèque suit des protocoles validés avec des points de contrôle de qualité internes. Le séquençage est effectué sur des plateformes Illumina NovaSeq, avec une configuration de lecture et une profondeur adaptées au type d'essai et aux objectifs du projet. L'analyse bioinformatique se déroule via Cell Ranger, Seurat v5 et ScanPy — couvrant la démultiplexion, l'alignement, le filtrage des codes-barres cellulaires, l'élimination de l'ARN ambiant, la normalisation, la réduction de dimensionnalité, le clustering et l'annotation des types cellulaires. Les livrables en aval incluent des rapports HTML interactifs avec des visualisations UMAP, des tableaux de gènes marqueurs de clusters et des résultats d'expression différentielle.

Pour la transcriptomique spatiale, le pipeline d'analyse ajoute un clustering conscient de l'espace, une sélection de spots guidée par l'histologie et une intégration avec des données scRNA-seq appariées. Pour les projets multi-omiques, l'analyse des voisins les plus proches pondérés dans Seurat v5 intègre les modalités au sein d'une réduction de dimensionnalité partagée. Les exigences computationnelles ne sont pas triviales : un ensemble de données standard de 50 000 cellules nécessite entre 32 et 64 Go de RAM rien que pour le prétraitement, et les besoins en mémoire évoluent de manière non linéaire avec le nombre de cellules. Infrastructure bioinformatique dédiée avec Cell Ranger, Seurat v5 et des pipelines ScanPy préconfigurés gèrent automatiquement cette mise à l'échelle, permettant aux chercheurs de se concentrer sur l'interprétation biologique plutôt que sur la configuration du serveur.

FAQ

Quand devrais-je choisir le scRNA-seq plutôt que le RNA-seq en vrac ?

Choisissez le scRNA-seq lorsque vous devez résoudre l'hétérogénéité cellulaire — identifier des types de cellules, détecter des sous-populations rares ou tracer des trajectoires de développement. Choisissez le RNA-seq en vrac lorsque vous avez purifié une population cellulaire spécifique et que vous avez besoin d'un profilage transcriptomique approfondi à un coût inférieur par échantillon. Pour des comparaisons entre plusieurs conditions, envisagez "d'abord le dépistage, puis le zoom" : dépistage en vrac d'abord, scRNA-seq sur les meilleurs résultats.

Quelle est la différence entre scRNA-seq et snRNA-seq ?

scRNA-seq utilise des cellules intactes provenant de tissus frais et capture l'ARNm cytoplasmique. snRNA-seq utilise des noyaux isolés provenant de tissus frais, congelés ou difficiles à dissocier et capture les transcrits nucléaires, évitant ainsi les artefacts de stress transcriptionnel induits par la dissociation enzymatique. snRNA-seq est la méthode de choix pour les tissus congelés archivés et les expériences nécessitant l'ATAC-seq à partir du même échantillon.

Quelle plateforme de transcriptomique spatiale devrais-je choisir ?

Utilisez Visium Fresh Frozen pour la découverte du transcriptome entier dans n'importe quelle espèce, y compris les organismes non-modèles. Utilisez Visium HD pour le cartographie spatiale à résolution unicellulaire d'échantillons FFPE humains ou murins. Utilisez Xenium pour la localisation des transcrits subcellulaires avec un retour sur la morphologie cellulaire. Utilisez Stereo-seq pour le cartographie de grandes zones — embryons entiers, sections transversales d'organes entiers. De nombreux projets bénéficient de la combinaison de deux plateformes : une pour la découverte, une pour la validation.

Combien de cellules dois-je profiler ?

Ciblez au minimum 500 cellules par type cellulaire et par réplique biologique pour une analyse quantitative. Travaillez à rebours à partir de votre population d'intérêt la plus rare : si elle représente 1 % des cellules d'entrée, capturez au moins 50 000 cellules. Si l'enrichissement par FACS est réalisable, le nombre de cellules à capturer diminue considérablement.

Combien de lectures de séquençage par cellule ai-je besoin ?

Pour la classification des types cellulaires, 20 000 à 25 000 paires de lectures par cellule. Pour l'expression différentielle au sein d'un type cellulaire, 50 000 paires de lectures par cellule. Pour détecter des transcrits à faible abondance, 50 000 à 100 000 ou plus par cellule. En cas de doute, séquencez un échantillon pilote et vérifiez la courbe de saturation.

Ai-je besoin de réplicats biologiques pour des expériences sur des cellules uniques ?

Oui. Les cellules individuelles ne peuvent pas remplacer les réplicats biologiques. Utilisez un minimum de trois réplicats biologiques par condition. Appliquez le pseudobulking — en agrégeant les comptages au sein de chaque type cellulaire et réplicat — puis utilisez DESeq2 ou edgeR pour le test d'expression différentielle. L'analyse au niveau des cellules individuelles sans pseudobulking produit des taux de faux positifs de 30 à 80 pour cent.

CD Genomics peut-il traiter des organismes non-modèles ?

Oui. Les plateformes Visium Fresh Frozen et Stereo-seq utilisent une chimie de capture poly(A), qui fonctionne avec n'importe quelle espèce possédant un transcriptome polyadénylé — aucun panneau de sondes spécifique à une espèce n'est requis. Nous avons traité des échantillons de poisson zèbre, d'axolotl, de riz, de peuplier, de porc, de vache et de nombreuses autres espèces de recherche non standard.

Quel est le délai de traitement pour un projet typique de cellule unique ?

Pour un projet standard de 4 à 8 échantillons, prévoyez 3 à 4 semaines entre la réception des échantillons et l'achèvement du séquençage, plus 2 à 4 semaines pour une analyse bioinformatique complète. Des délais accélérés sont disponibles.

Références :

1. Luecken MD, Theis FJ. Meilleures pratiques actuelles dans l'analyse de l'ARN-seq à cellule unique : un tutoriel. Biologie des systèmes moléculaires. 2019;15(6):e8746. doi : 10.15252/msb.20188746
2. Schmid KT, Cruceanu C, Boettger A, et al. scPower accélère et optimise la conception d'études transcriptomiques unicellulaires à échantillons multiples. Communications Nature. 2021;12:6627. doi:10.1038/s41467-021-26779-7
3. Squair JW, Gautier M, Kathe C, et al. Confrontation des fausses découvertes dans l'expression différentielle à cellule unique. Nature Communications. 2021;12:5692. doi:10.1038/s41467-021-25960-2
4. Du J, Yang YC, An ZJ, et al. Avancées en transcriptomique spatiale et stratégies d'analyse de données associées. Journal de Médecine Translationnelle. 2023;21:330. doi:10.1186/s12967-023-04150-2
5. Zheng GXY, Terry JM, Belgrader P, et al. Profilage transcriptionnel numérique massivement parallèle de cellules uniques. Communications Nature. 2017;8:14049. doi:10.1038/ncomms14049
6. Argelaguet R, Arnol D, Bredikhin D, et al. MOFA+: un cadre statistique pour l'intégration complète des données unicellulaires multi-modales. Biologie du génome. 2020;21:111. doi : 10.1186/s13059-020-02015-1
7. Fang S, Chen B, Zhang Y, et al. Approches computationnelles et défis en transcriptomique spatiale. Génomique, Protéomique et Bioinformatique2023 ; 21(1) : 13-23. doi:10.1016/j.gpb.2022.09.006
8. Yue L, Liu F, Hu J, et al. Un guide des technologies de transcriptomique spatiale, des ressources de données et des approches d'analyse. Journal de biotechnologie computationnelle et structurale2023 ; 21 : 940-955. doi:10.1016/j.csbj.2023.01.016

À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.