Protocole pour l'extraction/purification de l'ARN total

L'acquisition d'ARN de haute qualité est la première étape critique pour réaliser une analyse d'ARN, y compris la PCR, la transcription inverse en temps réel PCR (RT-qPCR), le profilage de l'expression génique avec microarray, le séquençage d'ARN et l'analyse nordique, etc. L'extraction totale d'ARN (également connue sous le nom de purification d'ARN) est le processus d'extraction des molécules d'ARN à partir d'échantillons biologiques, tels que la culture cellulaire, les tissus, le FFPE, le sang. Les problèmes les plus importants liés au processus de purification d'ARN incluent l'intégrité de l'ARN, la pureté et une quantité suffisante. L'ARN de haute qualité est exempt d'ADN génomique ou d'inhibiteurs, et n'est pas dégradé.

Ensuite, nous allons introduire une méthode manuelle d'extraction/purification d'ARN qui convient à tous les types de tissus de la majorité des espèces végétales et animales. Le protocole peut légèrement varier entre les scientifiques. Vous pouvez également choisir des kits disponibles dans le commerce qui utilisent des colonnes à centrifuger ou des billes magnétiques. L'ARN est très instable, donc tous les réactifs et matériaux doivent être exempts de RNase.

Matériaux :

• Réactif TRIzol frais : 40 % p/p de phénol, 1 M de thiocyanate de guanidine, 1 M de thiocyanate d'ammonium, tampon acétate de sodium 0,1 M (pH=5,0), 5 % p/p de glycérol
• Mélange de chloroforme et d'alcool isoamyle (24:1)
• Isopropanol à 100 %
• Ethanol à 70 %
• LiCl à 10 M
• ddH₂O frais exempt de RNase ou 1xTE autoclave

Équipement et consommables

• MM300 Mixer Mill
• Microcentrifugeuse de table
• Vortexeur
• Pipetteurs
• Tubes de microcentrifugeuse

1. Congeler un tube de microcentrifugeuse Eppendorf de 2 ml avec un échantillon de tissu et une bille de verre à -80°C, puis broyer l'échantillon dans le MM300 Mixer Mill à 30 Hz pendant deux minutes.

2. Ajouter 1 ml de réactif TRIzol frais à l'échantillon de tissu mécaniquement disrupté, bien vortexer et incuber l'échantillon à température ambiante pendant 5 minutes.

3. Ajouter 0,2 ml de chloroforme au tube de microcentrifugeuse pour l'homogénéisation. Bien vortexer et incuber l'échantillon à température ambiante pendant 3 minutes.

4. Centrifuger l'échantillon à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse de table à 4°C pendant 5 minutes.

5. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 2 ml. Ajouter un volume égal de chloroforme au nouveau tube de microcentrifugeuse, bien vortexer. Tourner à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse de table pendant 5 minutes.

6. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 2 ml. Ajouter un volume égal d'isopropanol au nouveau tube de microcentrifugeuse, bien vortexer. Tourner à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse de table à 4°C pendant 10 minutes.

7. Laver le précipité avec 1,5 ml d'éthanol à 70 %. Tourner à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse de table pendant 5 minutes.

8. Dissoudre le précipité dans 400 μl de 1xTE à 55°C en vortexant bien. Ajouter un volume égal de LiCl à 10 M à la solution et la refroidir à -20°C pendant plusieurs heures (ou toute la nuit).

9. Tourner le tube à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse de table à 4°C pendant 10 minutes. Retirer soigneusement et jeter le surnageant (contient de l'ADN et des petits ARN < 200 nt).

10. Laver le précipité avec 1,5 ml d'éthanol à 70 %, bien vortexer. Tourner le tube à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse de table à 4°C pendant 10 minutes. Jeter l'éthanol, ne pas sécher le précipité.

11. Dissoudre le précipité dans 200-400 μl de ddH₂O frais exempt de RNase ou 1xTE.

Comment vérifier la qualité de l'ARN ?

L'électrophorèse peut être utilisée pour vérifier la qualité de l'ARN, y compris la quantité et l'intégrité. Charger 5 μl de la solution sur un gel d'agarose standard à 1,5 % avec un tampon 1xTHE. Ajouter du bromure d'éthidium (EB) au gel. Charger une quantité connue d'ADN dans une voie voisine pour servir de standard de concentration. L'ARN intact présente des bandes nettes de l'ARN ribosomique.

Lectures supplémentaires :

Les méthodes d'extraction et de purification de l'ADN

Récupération de l'ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes sans utiliser de kits

Directives de soumission d'échantillons pour le séquençage à haut débit