Les méthodes d'extraction et de purification de l'ADN

Une brève introduction à l'ADN

L'acide désoxyribonucléique est l'une des molécules essentielles à la vie qui transporte des instructions génétiques pour guider l'hérédité biologique, le développement biologique et le fonctionnement vital. La structure de l'ADN dans les cellules eucaryotes est appelée double hélice, formée par l'enroulement antiparallèle de deux chaînes de polynucléotides. L'extraction de l'ADN est une étape critique et fondamentale dans les expériences moléculaires. Dans de nombreux laboratoires, la méthode de lyse alcaline est utilisée pour extraire l'ADN. Pour une extraction d'ADN réussie, plusieurs critères de mesure doivent être respectés : il est nécessaire d'assurer l'intégrité de la structure primaire de l'acide nucléique, A260/A280=1,8~2,0, une faible concentration d'ions salins, et une pollution minimale d'autres biomacromolécules telles que les protéines, les polysaccharides et les molécules lipidiques. Un ADN de haute qualité et purifié est très important pour la recherche en aval, telle que recherche génomique et recherche épigénomique.

Extraction d'ADN à partir de cellules cultivées in vitro

1. Collecter les cellules. (Les cellules sont directement centrifugées pour obtenir un culot cellulaire, et les cellules adhérentes doivent être digérées avec de la trypsine et collectées par centrifugation.)

2. Resuspendre les cellules et rincer une fois avec du PBS pré-refroidi.

3. Répétez l'étape 2.

Ajoutez 2 mL de tampon d'extraction d'ADN (10 m mol/L Tris-cl, 0,1 mol/L EDTA, 0,5 % SDS) et mélangez.

5. Ajouter de la protéinase K à une concentration finale de 100 μL/mL et effectuer un bain-marie à 50 °C pendant 3 heures.

6. Ajoutez un volume égal de phénol, centrifugez à 2 500 tr/min pendant 15 minutes et recueillez la phase aqueuse.

7. Ajoutez un volume égal de mélange de phénol, chloroforme et alcool isoamyle, centrifugez à 2 500 tr/min pendant 15 minutes et collectez la phase aqueuse.

Ajoutez 0,1 volume d'acétate de sodium 3M et 3 volumes d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 °C pendant la nuit.

9. Centrifuger à 12 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C.

10. Lavez avec 80 % d'éthanol pré-refroidi deux fois.

11. Resuspendre le culot blanc dans une quantité appropriée de tampon TE ou d'eau distillée déionisée (ddH).₂La solution résultante est l'ADN cellulaire.

Purification et concentration de l'ADN

• Précipitation de l'ADN par éthanol

1. Placez la solution d'ADN dans un tube à centrifuger et ajoutez 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M et 3 volumes d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 °C pendant la nuit.

2. Centrifugez à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.

3. Lavez avec 80 % d'éthanol pré-refroidi deux fois.

4. Resuspendre le pellet blanc dans une quantité appropriée de tampon TE ou ddH.₂O. La solution résultante est l'ADN cellulaire.

L'acétate de sodium fournit des ions salins pour la précipitation de l'ADN, qui peut être ajouté un peu plus et doit finalement être éliminé. Une partie de l'ADN est perdue lors du processus de purification et de concentration de l'ADN, et le taux de récupération de l'ADN est d'environ 80 %.

• Précipitation de l'ADN par isopropanol

0,7 fois le volume d'isopropanol à température ambiante est ajouté (par exemple, 0,7 mL d'isopropanol est ajouté à 1 mL du plasmide à concentrer). Après mélange, le mélange est centrifugé à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C, et le surnageant est soigneusement aspiré pour éviter tout contact avec le précipité. Notez que l'ADN précipité par l'isopropanol est un précipité vitreux, presque transparent, granulaire, qui est difficile à voir par rapport aux précipités contenant du sel produits par la précipitation à l'éthanol. Centrifugez le tube de centrifugation aussi doucement que possible pour éviter les sédiments lâches ou certaines particules en suspension dans la solution. Ne versez pas directement le surnageant. Utilisez une pipette pour absorber délicatement le surnageant et veillez à éviter l'aspiration.

Lectures supplémentaires:

Directives de soumission d'échantillons pour le séquençage à haut débit

Récupération de l'ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes sans utiliser de kits

Références :

1. Ayoib Adilah, Hashim Uda, Gopinath Subash C B et al.Extraction d'ADN sur bio-puce : histoire et prééminence sur les méthodes d'extraction conventionnelles et en phase solide.. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2017, 101(22) : 8077-8088.
2. Zielińska Sylwia, Radkowski Piotr, Blendowska Aleksandra et al.Le choix de la méthode d'extraction de l'ADN peut influencer le résultat de l'analyse de la structure de la communauté microbienne du sol. Microbiologyopen, 2017, 6(4).
3. Gerasimidis Konstantinos, Bertz Martin, Quince Christopher et al.. L'effet de la méthodologie d'extraction de l'ADN sur les applications de recherche sur le microbiote intestinal. BMC Res Notes,2016, 9 : 365.
4. Bitting Anna L, Bordelon Hali, Baglia Mark L et al.Dispositif automatisé pour l'extraction asynchrone d'ARN, d'ADN ou de biomarqueurs protéiques à partir d'échantillons de patients de substitutionJ Lab Autom, 2016, 21(6) : 732-742.
5. Casaril Aline Etelvina, de Oliveira Liliane Prado, Alonso Diego Peres et al.Standardisation de l'extraction d'ADN à partir de mouches de sable : Application au génotypage par séquençage de nouvelle génération.Exp. Parasitol, 2017, 177 : 66-72.