Directives de soumission d'échantillons pour le séquençage à haut débit

échantillons d'ADN

Il est recommandé de stocker les échantillons d'ADN à -20℃. Pour un stockage ou un transport à court terme, les échantillons d'ADN peuvent être conservés à 4℃ ou transportés avec des packs de gel réfrigérant ou des packs de glace. Pour un transport de longue durée, il est conseillé d'utiliser de la glace carbonique et des packs de glace. Les exigences relatives aux échantillons d'ADN sont présentées dans le Tableau 1.

Tableau 1. Exigences pour les échantillons d'ADN.

Type de séquençage	Type de bibliothèque	Exigence d'échantillon
séquençage génomique	Petite bibliothèque de fragments	≥ 300ng, OD260/280 : 1,8-2,2, concentration > 10ng/μl, volume > 10μl. Les bandes d'ADN de l'électrophorèse sur gel d'agarose sont claires et sans dégradation, sans contamination par l'ARN et les protéines, et les échantillons sont clairs, incolores, collants et solubles.
séquençage génomique	Bibliothèque Pacbio (Bibliothèque 10/20K)	≥ 10μg, concentration > 100ng/μl, rapport OD260/280 : 1,8-2,0, rapport OD260/230 : 2,0-2,2. Le rapport de concentration Nanodrop à concentration Qubit est ≤ 2, l'échantillon est clair et incolore, et il n'y a pas de matière insoluble ; la bande d'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose est claire et ne montre aucune dégradation de l'ADN, exempte de contamination par l'ARN et les protéines.
Séquençage de métagénome		≥ 300ng, OD260/280 : 1,8-2,2, concentration > 2ng/μl, volume > 10μl. Les bandes de gel d'agarose sont claires et pas significativement dégradées.
Séquençage 16S/18S/ITS		≥ 15ul, la concentration du résultat d'amplification ≥ 10nM et la concentration génomique ≥ 0,05ng/ul.
ChIP-Seq		≥ 30ng, concentration ≥1ng/μl, volume ≥10μl, la forme de pic est normalement distribuée entre 100-500bp, avec un pic principal à 200-400bp. L'échantillon est clair, incolore, non visqueux, soluble et exempt de contamination par des protéines.
Séquençage de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome entier		≥ 1,5 μg, le rapport 260/280 est compris entre 1,8 et 2,2, la concentration ≥ 20 ng/μl, et le volume est supérieur à 10 μl. La bande d'électrophorèse sur gel d'agarose ne montre aucune dégradation significative, et l'échantillon est clair et incolore, non visqueux et exempt de matière insoluble.
Séquençage de l'exome	Échantillon génomique, pratiquement sans dégradation	≥ 300 ng, rapport 260/280 entre 1,8 et 2,2, concentration ≥ 2 ng/μl, volume ≥ 10 μl. La bande d'électrophorèse sur gel d'agarose ne montre pas de dégradation significative, et l'échantillon est clair et incolore, non visqueux et exempt de matière insoluble.
Séquençage de l'exome	Des échantillons spéciaux tels que les FFPE permettent une légère dégradation.	≥ 400ng, le rapport 260/280 est compris entre 1,8 et 2,2, la concentration ≥ 4ng/μl, et le volume ≥ 10μl. La bande d'électrophorèse sur gel d'agarose est supérieure à 500bp.
Séquençage d'amplicons	Petit fragment de bibliothèque construit directement	≥ 150ng, ratio 260/280 : 1,8-2,2, concentration ≥ 2ng/μl, volume ≥ 10μl. La taille du fragment est comprise entre 100bp et 500bp, et l'échantillon est clair et incolore, non visqueux et exempt de matière insoluble.
Séquençage d'amplicons	Besoin d'interrompre (taille de segment >1000pb)	≥ 500 ng, le rapport 260/280 est compris entre 1,8 et 2,2, la concentration est ≥ 20 ng/μl, et le volume est ≥ 10 μl. La bande d'électrophorèse sur gel d'agarose est claire et non significativement diffusée, et l'échantillon est clair et incolore, non visqueux et exempt de matière insoluble.
Échantillon de bibliothèque		La concentration de la bibliothèque ≥ 3nM (concentration quantitative qPCR), la concentration de la bibliothèque de couloir ≥ 5nM (concentration quantitative qPCR), le volume ≥ 15μl. L'échantillon ne contient pas de billes magnétiques, et la bibliothèque est compatible avec la plateforme de séquençage désignée. Autres notes : 1) La bibliothèque d'ADN est dissoute dans un tampon approprié d'Illumina Resuspension Buffer (RSB) ou autre tampon. 2) Les clients doivent fournir des informations sur l'espèce, la taille des fragments, la méthode de construction de la base de données, le graphique de contrôle qualité Agilent 2100 Bioanalyzer et les résultats Qubit. 3) La taille de la bibliothèque HiSeq est comprise entre 300bp et 500bp, la taille de la bibliothèque MiSeq est comprise entre 300bp et 600bp (sans dimère de primer et dimère de linker).

échantillon d'ARN

Les échantillons d'ARN doivent être stockés à -80°C. De la glace carbonique ou de l'azote liquide peuvent être utilisés pour un stockage ou un transport à court terme. Pour un transport à long terme, il est recommandé de précipiter l'ARN dans de l'éthanol à 75 % et de le transporter avec une quantité suffisante de glace carbonique ou de glace bleue (2 kg/jour). Les exigences pour les échantillons d'ARN sont présentées dans le tableau 2.

Tableau 2. Exigences des échantillons d'ARN.

Type de séquençage	Type d'espèce	Exigence d'échantillon
Bibliothèque de dépistage PolyA	Mammifères	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 28S/18S ≥ 1.0, concentration > 50ng/μl, volume ≥ 10 μl, pic normal 5S. La forme du pic 2100 est normale, l'échantillon est clair et incolore, non visqueux, sans matière insoluble.
	Insectes	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2,0, concentration > 50ng/μl, volume ≥ 10μl, pas d'augmentation (déletion) à la ligne de base, pic 5S normal. La forme du pic 2100 est normale, l'échantillon est clair et incolore, pas visqueux, pas de matière insoluble.
	Plantes, champignons, levures, autres animaux	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 6.5, 28S/18S ≥ 1.0, concentration > 50ng/μl, volume ≥ 10μl, le pic 5S est normal. La forme du pic 2100 est normale, l'échantillon est clair et incolore, non visqueux, sans matière insoluble.
bibliothèque d'élimination de l'ARNr	Organismes eucaryotes (lncRNA)	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 23S/16S ≥ 1.0, concentration > 100 ng/μl, volume ≥ 10μl, le pic de 5S est normal.
bibliothèque d'élimination de l'ARNr	Prokaryotes	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 23S/16S ≥ 1.0, concentration > 100 ng/μl, volume ≥ 10μl, le pic 5S est normal. L'échantillon est clair, incolore, non visqueux et exempt d'insolubles.
Séquençage des petits ARN	Mammifères	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 8, 28S/18S ≥ 1.0, concentration > 170ng/μl, volume ≥ 10μl, pic de 5S normal. L'échantillon est clair, incolore, non visqueux et exempt d'insolubles.
	Insectes	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, concentration > 170 ng/μl, volume ≥ 10μl, pas d'élévation au niveau de la ligne de base, pic 5S normal. L'échantillon est clair, incolore, non visqueux et exempt d'insolubles.
	Plantes, champignons, levures, autres animaux	≥ 2 μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7.5, 28S/18S ≥ 1.0, concentration > 170 ng/μl, volume ≥ 10 μl, pic de 5S normal. L'échantillon est clair, incolore, non visqueux et exempt d'insolubles.
Transcriptome macro		≥ 3μg, concentration ≥ 100ng/μl, RIN ≥ 6.5, volume ≥ 10μl, l'échantillon est clair et incolore, sans viscosité, sans matière insoluble.
Séquençage du transcriptome complet		3-5μg ou plus, concentration ≥ 500ng/μl, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 9, 23S/16S ≥ 1.0, le volume ≥ 10μl, et le pic 5S est normal.

Échantillon de tissu

Si l'ADN doit être isolé, les échantillons de tissu peuvent être stockés ou transportés pendant une courte période et conservés ou transportés à 4 °C. Pour un transport à long terme, de la glace carbonique et des packs de glace sont recommandés. Si l'ARN doit être extrait, les échantillons de tissu doivent être transportés en utilisant de la glace carbonique ou de l'azote liquide. Veuillez clairement indiquer le nom de l'échantillon, placer le tube d'échantillon dans un tube de centrifugeuse de 50 ml ou une boîte d'échantillons, puis l'emballer correctement avec de la mousse ou du coton pour garantir que l'échantillon arrive en bon état dans notre laboratoire.

Les exigences relatives aux échantillons de tissus sont présentées dans les tableaux 3 et 4.

ADN Les rendements en ADN des différents types d'échantillons varient considérablement. Veuillez soumettre les échantillons en fonction des conditions réelles des échantillons et des exigences de construction de bibliothèques de séquençage. Les échantillons de tissu pour les services de séquençage liés à l'ADN doivent être expédiés avec des packs de glace.

Tableau 3. Exigences en échantillons de tissu pour le séquençage de l'ADN.

Type d'échantillon	Exigence d'échantillon
Sang	≥ 2 ml de sang frais ou cryopréservé avec anticoagulation (sang total ou globules blancs extraits du sang total), un anticoagulant EDTA est recommandé, et l'anticoagulation par héparine ne peut pas être utilisée pour éviter d'affecter l'expérience.
Tissu isolé	≥ 0,5 g de tissu animal, ≥ 2 g de tissu végétal.
Cellule	≥ 5X10⁶
Échantillon bactérien	≥ 1 g de précipité de corps bactérien (environ ≥ 10 ml dans la phase de croissance logarithmique du liquide bactérien) ; bibliothèque Pacbio : ≥ 15 g de corps bactérien sont nécessaires pour le précipité (environ ≥ 150 ml dans la phase de croissance logarithmique).
échantillon FFPE	Au moins 10 coupes sans coloration HE, d'une épaisseur de ≥ 5 microns, la surface du tissu sur la coupe doit être ≥ 25 millimètres carrés, dont le nombre de cellules nucléées représente plus de 80 % de toutes les cellules, et le contenu en tissu tumoral ≥ 70 %.
Échantillon de séquençage 16S/ITS/18S	Quantité précipitée > 2g, volume > 10ml, qui est spécifiquement déterminée en fonction de l'abondance du microorganisme.
Échantillon métagénomique	Échantillons environnementaux : 5-10g de sol ; 3-5g de fèces ; 5-10g de sédiment ; 25ml de solution. Eau : volume : 5-10ml, passée à travers un filtre de taille de pore 0,22μm ou 0,45μm.

ARN Les rendements en ARN de différents types d'échantillons varient considérablement. Veuillez soumettre des échantillons en fonction des conditions réelles des échantillons et des exigences de construction de bibliothèques de séquençage. Les échantillons de tissu pour les services de séquençage liés à l'ARN sont transportés à l'aide de glace carbonique ou d'azote liquide, sauf indication contraire.

Tableau 4. Exigences en échantillons de tissu pour le séquençage de l'ARN.

Type d'échantillon	Exigence d'échantillon
Sang	≥5 ml de lymphocytes prélevés sur du sang total. La quantité d'échantillons d'oiseaux ou de poissons peut être réduite de manière appropriée. Il est recommandé de lyser complètement les lymphocytes avec 20 volumes de TRIzol LS. Les clients peuvent également envoyer des échantillons de sang total congelés à l'azote liquide. Il est suggéré d'ajouter 3 fois le volume de liquide lytique TRIzol LS au sang frais et de l'envoyer avec de la glace carbonique. Les clients doivent assumer le risque lié à l'extraction des échantillons.
Tissu frais	≥ 500 mg. Ou augmentez la quantité d'échantillon si l'échantillon contient des fibres musculaires ou des graisses, car il a une faible teneur en ARN. ≥ 1 g de tissu végétal. Pour les tissus végétaux complexes contenant des polyphénols polysaccharidiques, veuillez envoyer autant d'échantillons que possible. Il est recommandé d'emballer le tissu frais dans du papier aluminium ou de le placer dans des tubes EP après lavage et de le congeler avec de l'azote liquide dans les 3 minutes.
Cellule	≥ 5X10⁶Veuillez laver et précipiter le culot, entièrement lysé avec TRIzol, et l'envoyer.
Échantillon bactérien	≥ 500 mg de précipité de bactéries fraîches est rapidement congelé par azote liquide en moins de 3 minutes. Les échantillons fongiques ne sont pas recommandés pour la conservation dans le lysis TRIzol.
Échantillon de séquençage à haut débit	Les clients collectent des cellules PBMC de sang ; le nombre total de cellules est compris entre 1X10.⁶-5X10⁶, complètement lyse avec 1 ml de TRIzol ; envoyez-le avec de la glace sèche.

Lectures supplémentaires

Les méthodes d'extraction et de purification de l'ADN

Récupération de l'ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes sans utiliser de kits

À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.

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