Récupération de l'ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes sans utiliser de kits

Introduction

De nombreuses techniques de biologie moléculaire, telles que séquençage complet de l'ADN plasmidique, nécessitent de l'ADN plasmidique hautement purifié et concentré, et les plasmides bactériens sont largement utilisés comme vecteurs de clonage pour la recombinaison de l'ADN. Après la construction d'un nouveau plasmide, sa taille et son spectre d'endonucléases de restriction peuvent être déterminés par électrophorèse sur gel. Cet article présentera deux protocoles efficaces pour l'extraction de plasmides sans utiliser de kits.

Protocole A

Équipement

• Microcentrifuge de bureau
• Vortexeur de bureau

Réactifs

• Solution dénaturante
• Solution de renaturation
• éthanol à 100 % ou isopropanol
• éthanol à 70%
• Tampon TE ou eau

Protocole

1. Cultivez une culture de bactéries du jour au lendemain.

2. Centrifugez la culture pour précipiter les bactéries avant la préparation de l'ADN.

3. Enlevez le surnageant et resuspendez les bactéries dans le tampon.

4. Ajoutez une solution dénaturante aux bactéries resuspendues afin de provoquer la lyse des bactéries et de libérer leur contenu.

5. Ajoutez une solution de renaturation aux bactéries dénaturées afin de précipiter les protéines et l'ADN génomique et de laisser les plasmides libres en solution.

6. Précipitez la protéine et l'ADN génomique par centrifugation, puis retirez le surnageant contenant les plasmides.

7. Ajoutez soit de l'éthanol, soit de l'isopropanol pour précipiter l'ADN plasmidique.

8. Précipitez l'ADN en utilisant une centrifugeuse ou appliquez la solution sur une colonne qui se liera à l'ADN.

9. Lavez le culot ou la colonne avec de l'éthanol à 70 % pour éliminer l'excès de sel.

10. Resuspendre le pellet d'ADN ou éluer l'ADN de la colonne en utilisant de l'eau ou un tampon neutre tel que le TE.

Protocole B : la méthode d'extraction alcaline

Équipement

• Tubes en polypropylène de type Eppendorf (1,5 ml)
• Une centrifugeuse de paillasse capable de générer 8-10 000 xg

Réactifs

• Solution I : Solution de lysozyme - 2 mg/ml de lysozyme, 50 mM de glucose, 10 mM de CDTA, 25 mM de Tris-HCl (pH 8,0)
• Solution II : Solution alcaline de SDS - 0,2 N NaOH, 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS)
• Solution II : Solution saline élevée - 3 M d'acétate de sodium (pH 4,8)
• 0,1 M acétate de sodium / 0,05 M Tris-HCl (pH 8)
• Éthanol froid

Protocole

1. Cultivez une culture de bactéries du jour au lendemain.

2. Transférez 0,5 ml de culture dans un tube Eppendorf de 1,5 ml pour l'extraction de plasmides.

3. Centrifugez la culture pour précipiter les bactéries avant de procéder à la préparation de l'ADN.

4. Enlevez le surnageant, ajoutez 100 µl de Solution I, resuspendre le culot cellulaire et incuber à 0 °C pendant 30 min.

5. Ajoutez 200 µl de la Solution II et faites tourner doucement. La suspension devrait devenir presque claire et légèrement visqueuse. Gardez le tube à 0 °C pendant 5 minutes.

6. Ajouter 150 µl de la Solution III et mélanger doucement le contenu du tube par inversion pendant quelques secondes, pendant lesquelles un caillot d'ADN se forme. Le tube est conservé à 0 °C pendant 60 minutes.

7. Centrifugez pendant 5 minutes à 10 000 xg.

8. Retirez le surnageant et transférez-le dans un deuxième tube de centrifugeuse, ajoutez 1 ml d'éthanol froid et placez le tube à -20°C pendant 30 minutes.

9. Collectez le précipité par centrifugation pendant 2 minutes.

10. Enlevez le surnageant et dissolvez le culot dans 100 µl de sodium acétate 0,1 M/Tris-HCl 0,05 M (pH 8) et re-précipitez-le avec 2 volumes d'éthanol froid, pendant 10 minutes à -20℃.

11. Centrifugez pendant 5 minutes à 10 000 xg et dissolvez les pellets dans 40 μl d'eau.

Chez CD Genomics, nous fournissons séquençage complet de l'ADN plasmidique pour vous aider à étudier l'évolution des plasmides, leur structure modulaire et l'existence de points chauds pour l'insertion de gènes accessoires.

Lectures supplémentaires

Les méthodes d'extraction et de purification de l'ADN

Directives de soumission d'échantillons pour le séquençage à haut débit

Référence :

1. 1. Bimboim H C, Doly J. Une procédure d'extraction alcaline rapide pour le dépistage de l'ADN plasmidique recombinant. Recherche sur les acides nucléiques, 1979, 7(6) : 1513-1523.