Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que l'analyse de la longueur de la queue Poly(A) ?
L'analyse de la longueur de la queue poly(A) est la mesure quantitative des séquences riches en adénosine ajoutées aux extrémités 3' des transcrits d'ARNm eucaryotes. Ces queues régulent la stabilité de l'ARNm, l'exportation nucléaire et l'efficacité de la traduction, rendant leur caractérisation précise essentielle pour comprendre la régulation génique post-transcriptionnelle. Chez CD Genomics, nous proposons un séquençage de transcrits complets avec un profilage simultané de la queue poly(A) utilisant des plateformes de séquençage Oxford Nanopore, offrant une résolution au niveau des bases à travers les isoformes et les types cellulaires.
Les queues Poly(A) ne sont pas des structures statiques. Leur longueur varie dynamiquement selon les stades de développement, les tissus et les conditions de stress — et leur composition inclut souvent des résidus non-adenosine internes (U, G ou C) qui portent des signaux régulateurs distincts. Capturer cette complexité nécessite des méthodes qui lisent le transcript complet de l'extrémité 5' à l'extrémité 3' en un seul passage, ce que nos workflows de séquençage à lecture longue sont précisément conçus pour faire.
Ce service s'intègre parfaitement avec séquençage d'ARNm des flux de travail et élargit les analyses transcriptomiques conventionnelles vers une nouvelle dimension régulatrice — une dimension qui devient de plus en plus centrale pour les thérapies à base d'ARNm, la biologie du développement et la recherche sur l'amélioration des cultures.
Pourquoi les méthodes conventionnelles sont insuffisantes
Les méthodes de séquençage à court et les méthodes traditionnelles laissent des dimensions critiques de la biologie des poly(A) invisibles. Voici pourquoi les chercheurs passent aux plateformes de séquençage à long-read.
L'électrophorèse sur gel et la LC-MS mesurent uniquement la longueur moyenne de la queue poly(A) dans une population de transcrits, sans fournir de résolution spécifique aux isoformes ou au niveau des transcrits. Les méthodes de séquençage à lecture courte comme TAIL-seq et mTAIL-seq offrent un meilleur débit mais sont techniquement limitées : elles ne peuvent pas séquencer la longueur totale des queues plus longues (la détection est généralement limitée à environ 230 nt) et elles lient les mesures de poly(A) aux lectures plutôt qu'aux isoformes de transcrits complets. PAL-seq est limitée à du matériel de séquençage discontinué. Aucune de ces méthodes ne peut simultanément cartographier les sites d'alternative polyadénylation (APA), détecter des résidus non-A internes et attribuer les résultats à des isoformes d'épissage spécifiques.
Le séquençage à lecture longue répond à ces trois limitations en une seule expérience, ce qui en fait la seule approche capable de fournir une biologie poly(A) complète dans un seul flux de travail sans sacrifier le contexte des isoformes.
Notre portefeuille technologique pour le profilage de Poly(A)
Nous proposons l'ensemble des méthodes d'analyse de poly(A), des techniques NGS établies aux plateformes de séquençage long de pointe. Notre équipe scientifique vous aidera à choisir la bonne approche en fonction de votre type d'échantillon, de l'organisme et de vos objectifs de recherche.
Méthodes basées sur le NGS (flux de travail complémentaires)
- TAIL-seq, mTAIL-seq, PAT-seq, TED-seq, et séquençage polyA (TAIL-seq) sont disponibles pour des projets nécessitant un profilage en vrac à haut débit à moindre coût.
- Fournir des données de référence solides sur les distributions de longueur de queue à travers de grands ensembles d'échantillons.
- Mieux associé aux résultats de lecture longue pour une compréhension mécaniste complète.
TAIL Iso-seq (Nanopore)
- Capture la structure du transcriptome complet avec quantification simultanée de la queue poly(A).
- Idéal pour la recherche sur les plantes, les études de stress des cultures et les flux de travail en transcriptomique large.
- Sortie en temps réel et longueurs d'exécution flexibles pour des projets et des organismes sensibles au temps sans génomes de référence.
Nano 3P-seq (Nanopore)
- Approche sans enrichissement en poly(A) utilisant Séquençage d'ARN direct par nanopore qui évite le biais de sélection oligo(dT).
- Permet la détection impartiale des courtes queues (≥10 nt) ainsi que des longues.
- Idéal pour les études dynamiques de poly(A) où le raccourcissement de la queue est le signal biologique d'intérêt.
FLEP-seq / FLEP-seq2 (Nanopore)
- Détecte simultanément la position de l'ARN Pol II, l'état d'épissage, l'utilisation des sites APA et la longueur de la queue poly(A) à l'échelle du génome.
- L'approche à molécule unique la plus dense en informations pour les plantes et les organismes modèles.
- FLEP-seq2 offre une sensibilité améliorée et une compatibilité avec des échantillons à faible entrée.
Comparaison des technologies : Quelle méthode convient à votre recherche
Utilisez le tableau ci-dessous pour faire correspondre vos besoins en recherche à la plateforme de profilage poly(A) optimale. Notre équipe est disponible pour discuter de projets spécifiques lors de consultations.
| Fonctionnalité | NGS (TAIL-seq / mTAIL-seq) | Nanopore (TAIL Iso-seq / Nano 3P-seq) | PAIso-seq (PacBio HiFi) |
|---|---|---|---|
| Transcription complète + queue poly(A) | ✗ | ✓ | ✓ |
| Mesure précise de la longueur de la queue | Approximatif (≤230 nt) | ✓ (longueur complète) | ✓ (précision maximale) |
| Détection des résidus non-A internes | Limité | ✓ | ✓ |
| Cartographie des queues au niveau des isoformes | ✗ | Partiel | ✓ |
| Analyse de site APA dans la même course | ✗ | ✓ | ✓ |
| Précision des homopolymères | Sujets à erreurs | ✓ (tailfindr / nanopolish) | ✓ (Lectures HiFi CCS) |
| Le mieux adapté pour | Enquête de masse à haut débit | Plante, transcriptomique large | Précision, thérapies à faible apport |
Pour la plupart des projets de recherche en biologie de l'ARN et en développement, nous recommandons de choisir un flux de travail basé sur la technologie Nanopore en fonction du type d'échantillon, de l'objectif de recherche et des exigences de séquençage. Pour la transcriptomique des plantes et les projets sensibles aux coûts, TAIL Iso-seq ou FLEP-seq2 sont d'excellents choix. Notre équipe scientifique vous aidera à sélectionner la bonne approche lors d'une consultation pré-projet gratuite.
Flux de service
Profilage poly(A) de bout en bout — de l'échantillon aux données prêtes pour publication
Applications clés
Notre service de profilage poly(A) couvre un large éventail de questions biologiques, allant de la biologie fondamentale de l'ARN à l'optimisation des thérapies par ARNm.
Embryogenèse et élimination des transcrits maternels
Le remodelage de la queue poly(A) entraîne la transition maternelle-zygotique dans les ovocytes et les embryons précoces. Le séquençage RNA à lecture longue peut soutenir l'analyse spécifique des isoformes de la dynamique de la queue poly(A) dans les échantillons de biologie du développement, révélant une incorporation généralisée de résidus non-A qui guide le destin de l'ARNm.
Biologie des plantes et recherche sur le stress des cultures
TAIL Iso-seq et FLEP-seq2 fournissent un profilage poly(A) à l'échelle du transcriptome à travers les tissus végétaux, les stades de développement et les conditions de stress. Les distributions de longueur de la queue poly(A) sont spécifiques aux tissus et évolutivement conservées, ce qui en fait des marqueurs fiables pour la génomique fonctionnelle des cultures.
Thérapeutiques à base d'ARNm et conception de vaccins
La longueur et la composition de la queue poly(A) influencent directement la demi-vie de l'ARNm et la production translationnelle. Notre service soutient la conception rationnelle et le contrôle de qualité des charges utiles d'ARNm synthétiques pour les vaccins et les vecteurs de thérapie génique, aidant les équipes de biotechnologie à optimiser l'expression et la stabilité.
Profilage des queues de transcriptome à faible apport
Le profilage de la queue poly(A) à faible apport peut soutenir des échantillons de recherche limités lorsque la qualité de l'ARN, le type d'échantillon et les exigences de séquençage sont appropriés, étendant ainsi l'analyse résolue des isoformes à des échantillons qui étaient inaccessibles aux méthodes conventionnelles en vrac.
Recherche sur la polyadénylation alternative (APA)
Chaque séquence de lecture longue résout simultanément l'utilisation des sites APA ainsi que la longueur de la queue, permettant la découverte de motifs d'expression spécifiques aux isoformes et liant la variation du 3'UTR aux résultats de traduction. Pour analyse bioinformatique Au-delà des livrables standards, des pipelines d'intégration multi-omiques personnalisés sont disponibles.
Exigences d'échantillon
Tous les échantillons d'ARN doivent être dissous dans de l'eau sans RNase ou dans un tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,0. Mesurez la concentration par fluorométrie (Qubit ou équivalent). Expédiez sur de la glace sèche avec le formulaire de soumission d'échantillon rempli.
| Service | Type d'échantillon | Quantité recommandée | Quantité minimum | Concentration min. |
|---|---|---|---|---|
| TAIL Iso-seq (Nanopore) | ARN total | ≥2 µg | 100 pages | 1 ng/µL |
| Nano 3P-seq (Nanopore) | ARN total | ≥1–2 µg | 1 µg | 20 ng/µL |
| FLEP-seq / FLEP-seq2 (Nanopore) | ARN total | ≥2 µg | 1 µg | 50 ng/µL |
| Bibliothèque cDNA préfabriquée | Bibliothèque | ≥15 µL | 15 µL | 2 ng/µL |
- Qualité de l'ARN : OD A260/A280 ≥ 1,8, A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 7 (RIN ≥ 8 recommandé pour le séquençage à longues lectures).
- Échantillons à faible apport : Veuillez contacter notre équipe de projet avant la soumission pour des protocoles de traitement personnalisés.
- Délai de traitement : Projets standards : 2 à 4 semaines entre la réception de l'échantillon et la livraison des données, selon la plateforme et la complexité de l'échantillon. Des options accélérées sont disponibles sur demande.
Analyse bioinformatique et livrables
Notre pipeline de bioinformatique standard couvre toutes les principales sorties d'analyse sans coût supplémentaire. La longueur de la queue poly(A) est déterminée à l'aide de Nanopolish, Tailfindr ou d'autres pipelines d'analyse compatibles avec Nanopore. Nous détectons les résidus non-A internes (U, G, C) au sein des corps poly(A), cartographions les métriques poly(A) sur des isoformes de pleine longueur et relions la dynamique des queues à l'utilisation des sites APA. L'analyse différentielle de la longueur des queues entre les conditions utilise des outils validés, y compris NanopLen et des modèles linéaires mixtes.
- Données brutes : Fichiers FASTQ/BAM issus du séquençage Nanopore, avec des métriques complètes de la course de séquençage.
- Rapport QC : Métriques par échantillon incluant le nombre de lectures, la distribution de la longueur des lectures, le taux de mappage et les statistiques de la bibliothèque.
- Package d'Analyse Poly(A) : Graphiques de distribution de la longueur des queues (histogrammes, boxplots par gène, comparaisons tissulaires) ; cartes internes des résidus non-A (fréquence U/G/C par position et transcrit) ; tableau d'association de la longueur des queues au niveau des isoformes ; analyse de l'utilisation des sites APA et quantification de la longueur des 3'UTR ; comparaison différentielle de la longueur des queues entre les conditions.
- Sorties visuelles : Graphiques prêts à être publiés au format PDF/PNG — diagrammes de sashimi, graphiques en violon, cartes thermiques pour des comparaisons multi-échantillons.
- Appel de consultation : Session de revue scientifique avec notre équipe pour discuter des résultats et des stratégies expérimentales de suivi.
Des solutions bioinformatiques sur mesure — y compris l'intégration avec vos ensembles de données RNA-seq, protéomique ou de cellules uniques existants — sont disponibles sur demande.
Pourquoi s'associer à CD Genomics pour l'analyse de la longueur de Poly(A) ?
Nous apportons une vaste expérience en biologie de l'ARN à longues lectures, offrant une capacité de flux de travail basée sur Nanopore et un service complet de bout en bout — de la réception des échantillons à un résultat prêt pour publication.
- Expertise multi-plateforme : Compétence dans les flux de travail basés sur Nanopore, y compris TAIL Iso-seq, Nano 3P-seq et FLEP-seq2 — garantissant la bonne plateforme pour chaque projet.
- Validation d'entrée ultra-basse : Les échantillons à faible apport peuvent être évalués avant le début du projet pour déterminer la conception de flux de travail appropriée, les exigences de qualité de l'ARN et la faisabilité du séquençage.
- Détection complète des résidus non-A. Identification de base des résidus internes U, G et C au sein des queues poly(A) — au-delà de simples mesures de longueur de queue.
- Bioinformatique complète : Pipeline bioinformatique complet inclus sans coût supplémentaire — distributions de longueur de queue, analyse APA, cartes des résidus non-A et tableaux d'isoformes livrés ensemble.
- Sortie de qualité publication : Résultats formatés pour une soumission directe à des revues à fort impact, avec une esthétique des figures répondant aux normes éditoriales.
Références
- Liu Y, Nie H, Liu H, Lu F. Le séquençage des isoformes d'ARN inclusifs en poly(A) (PAIso-seq) révèle la présence répandue de résidus non-adénosine au sein des queues poly(A) de l'ARN. Nat Commun2019;10:5292. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
- Passmore LA, Coller J. Rôles des queues poly(A) de l'ARNm dans la régulation de l'expression génique eucaryote. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23(2):93-106. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
- Chang H, Lim J, Ha M, Kim VN. TAIL-seq : détermination à l'échelle du génome de la longueur de la queue poly(A) et des modifications de l'extrémité 3'. Mol Cell. 2014;53(6):1044-1052. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
Résultats de la démo
Distribution de la longueur de la queue poly(A) à l'échelle du transcriptome avec des pics bimodaux dans les tissus somatiques. Données générées par Nanopore TAIL Iso-seq. (Liu Y et al., Nat Commun, 2019)
Carte de position des résidus non-A internes (fréquence U/G/C à travers les positions de la queue poly(A), transcrits d'ovocytes GV de souris). (Liu Y et al., Nat Commun, 2019)
Comparaison de l'utilisation des sites APA résolus par isoforme entre les conditions, montrant un raccourcissement du 3'UTR. Généré à partir de données de séquençage long-read complètes.
Références
- Liu Y, Nie H, Liu H, Lu F. Le séquençage des isoformes d'ARN inclusifs en poly(A) (PAIso-seq) révèle la présence généralisée de résidus non-adénosine au sein des queues poly(A) de l'ARN. Nat Commun2019;10:5292. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
FAQs sur l'analyse de la longueur de la queue Poly(A)
1. Quel workflow Nanopore devrais-je choisir ?
Pour la transcriptomique des plantes, des enquêtes tissulaires plus larges, ou lorsque la sortie de données en temps réel est importante, le TAIL Iso-seq basé sur Nanopore ou le Nano 3P-seq peuvent être des options appropriées. Notre équipe recommandera l'approche optimale lors de la consultation gratuite avant le projet, en fonction du type d'échantillon, de l'entrée en ARN et des objectifs de recherche.
2. Pouvez-vous détecter des résidus internes U, G ou C au sein des queues poly(A) ?
Oui. Les méthodes basées sur les nanopores dans notre portefeuille peuvent être utilisées pour identifier les résidus non-adénosine au sein du corps des queues poly(A) — pas seulement à la position terminale 3'. Cette capacité est particulièrement pertinente pour les études des voies de dégradation de l'ARNm, de l'uridylation (médiée par TENT2) et de la guanylation des queues poly(A) médiée par TENT4A/B. Des cartes de résidus non-A internes sont incluses comme livrable pour les projets appropriés basés sur les nanopores.
3. Quelle est la précision de l'appel de longueur de poly(A) à longues lectures pour les homopolymères ?
Des algorithmes modernes spécifiquement conçus pour la mesure de poly(A) — y compris Tailfindr, Nanopolish et l'appelant Nano3P sur Nanopore — prennent en charge l'appel de la longueur de poly(A) à lecture longue. Nous incluons des contrôles de spike-in lorsque cela est nécessaire pour valider l'exactitude de l'appel de longueur de queue pour vos échantillons spécifiques.
4. Quelle est la quantité minimale d'ARN requise ?
Les exigences en matière d'entrées dépendent de la méthode basée sur Nanopore sélectionnée, du type d'échantillon, de la qualité de l'ARN et de la profondeur de séquençage souhaitée. Des entrées plus élevées, telles que 1 à 2 µg, sont recommandées pour une couverture à l'échelle du transcriptome. Veuillez contacter notre équipe avant de soumettre des échantillons à faible entrée afin que nous puissions préparer un protocole de manipulation approprié.
5. L'analyse de site APA est-elle incluse dans le service ?
Oui. Parce que nous séquençons des transcrits complets de la coiffe 5' à la queue poly(A) en une seule lecture, chaque course résout l'utilisation des sites de polyadénylation alternative (APA) en même temps que la mesure de la longueur de la queue — aucune préparation de bibliothèque supplémentaire ou course de séquençage n'est nécessaire. Les livrables en bioinformatique incluent la quantification des sites APA, l'analyse de la distribution de la longueur des 3'UTR, et la comparaison différentielle des APA entre les conditions comme résultats standards.
6. Ce service peut-il soutenir la recherche sur les vaccins ou les thérapies à base d'ARNm ?
La longueur et la composition de la queue Poly(A) affectent directement la demi-vie de l'ARNm et le rendement de la traduction dans les cellules. Notre service peut caractériser les propriétés de la queue des constructions d'ARNm synthétiques — informant des décisions de conception rationnelles pour les vaccins à ARNm, les vecteurs de thérapie génique et d'autres applications thérapeutiques. Nous travaillons régulièrement avec des équipes de biotechnologie et de pharmacie sur l'optimisation des charges utiles d'ARNm. Ce service est destiné à utilisation à des fins de recherche seulement et n'est pas destiné aux procédures cliniques ou diagnostiques.
Études de cas sur l'analyse de la longueur de la queue Poly(A)
Mise en avant de la recherche publiée
Le séquençage des isoformes d'ARN inclusifs en poly(A) (PAIso-seq) révèle la présence généralisée de résidus non adénosine au sein des queues poly(A) de l'ARN.
Journal : Communications Nature
Facteur d'impact : 14,7
Publié : novembre 2019
Contexte
Comprendre comment la longueur et la composition de la queue poly(A) sont régulées au niveau des isoformes d'ARNm individuelles a été un défi de longue date en biologie de l'ARN. Les méthodes existantes ne pouvaient pas lire simultanément les séquences de transcrits complets et leurs queues poly(A) complètes tout en détectant des bases internes non adénosiniques. Liu et al. ont entrepris de développer une méthode suffisamment sensible pour analyser un seul ovocyte de mammifère — l'un des échantillons biologiques les plus limités en recherche développementale — tout en fournissant une résolution au niveau des bases de la composition de la queue à travers l'ensemble du transcriptome.
Matériaux et Méthodes
Préparation d'échantillons
- Ovocytes de vésicule germinale (GV) de souris (en vrac + cellule unique)
- Deux répliques biologiques indépendantes (en vrac)
- 15 ovocytes GV individuels (validation unicellulaire)
- Standards poly(A) de spike-in pour la calibration de longueur
Séquençage
- Séquençage SMRT de PacBio (méthode PAIso-seq)
- Extension de fin + changement de modèle pour cDNA de longueur complète
- Ligation d'adaptateurs circulaires pour les lectures CCS
- Appel de la longueur de la queue poly(A) calibrée par spike-in
Analyse de données
- Cartographie de l'isoforme complet au transcriptome de référence
- Analyse de la distribution de la longueur de la queue poly(A)
- Identification des résidus non-A internes (U, G, C)
- Évaluation de la concordance entre cellules uniques et échantillons en vrac
Résultats
- Profilage Poly(A) à l'Échelle du Transcriptome à Résolution de Single-Oocyte
- L'analyse de deux bibliothèques d'ovocytes GV en vrac indépendantes a donné lieu à 79 994 et 227 902 transcrits cartographiés, confirmant la reproductibilité entre les répliques (Fig. 2).
- La distribution de la longueur de la queue poly(A) globale a montré un pic large et reproductible, cohérent à travers tous les réplicats et les échantillons unicellulaires.
- Le PAIso-seq à un seul ovocyte (0,5 ng d'entrée) a produit des résultats concordants avec le profilage en vrac, validant ainsi la méthode pour des échantillons rares et précieux.
Fig. 2 — Distribution mondiale des longueurs de queue poly(A) de tous les transcrits dans les ovocytes GV de souris. PAIso-seq capture des transcrits complets incluant la poly(A) avec une résolution au niveau des bases. (Liu Y et al., Nat Commun, 2019)
- Résidus non-adénosiniques répandus au sein des queues poly(A)
- 17 % des ARNm contenaient des résidus non-adénosine — U, G ou C — au sein du corps de leurs queues poly(A), et pas seulement à l'extrémité 3'.
- Les résidus non-A internes présentaient un biais de position vers la région 5' des queues poly(A) et variaient systématiquement entre les transcrits, suggérant des mécanismes régulateurs spécifiques aux gènes.
- Les motifs d'uridylation et de guanylation étaient liés aux voies de dégradation des ARNm connues, fournissant un contexte fonctionnel pour les données de composition de la queue.
- Dynamique des queues au niveau des isoformes
- Différentes isoformes d'épissage du même gène ont montré des distributions de longueur de queue poly(A) distinctes — une découverte invisible à toute approche de mesure par séquençage à court terme ou en vrac.
- L'intégration de la séquence complète des isoformes avec les métriques de poly(A) a ouvert une nouvelle dimension pour comprendre comment la régulation post-transcriptionnelle est coordonnée au niveau du transcript.
Conclusion
PAIso-seq a établi que les queues poly(A) ne sont pas des tractus A uniformes mais des structures hétérogènes avec des informations régulatrices intégrées. La sensibilité à une seule cellule de la méthode — validée ici en utilisant des ovocytes GV de souris avec un apport de 0,5 ng — a ouvert une nouvelle frontière pour l'étude d'échantillons biologiques précieux. Ces découvertes ont fourni la base méthodologique pour des travaux ultérieurs profilant la transition de l'ovocyte humain à l'embryon et les atlas poly(A) à l'échelle du transcriptome des plantes, et elles soutiennent directement le service PAIso-seq que CD Genomics propose désormais à la communauté de recherche mondiale.
Référence
- Liu Y, Nie H, Liu H, Lu F. Le séquençage des isoformes d'ARN inclusifs en poly(A) (PAIso-seq) révèle la présence généralisée de résidus non-adénosine au sein des queues poly(A) de l'ARN. Nat Commun2019;10:5292. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des contenus externes tels que des liens ou des articles. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
Publications connexes
Voici quelques publications qui ont été publiées avec succès en utilisant nos services ou des services de séquençage RNA à longues lectures associés :
Le séquençage des isoformes d'ARN inclusifs en poly(A) (PAIso-seq) révèle la présence répandue de résidus non-adénosine au sein des queues poly(A) de l'ARN.
Journal : Nature Communications
Année : 2019
Rôles des queues poly(A) de l'ARNm dans la régulation de l'expression génique eucaryote
Revue : Nature Reviews Molecular Cell Biology
Année : 2022
TAIL-seq : détermination à l'échelle du génome de la longueur de la queue poly(A) et des modifications de l'extrémité 3'
Journal : Cellule Moléculaire
Année : 2014
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