Séquençage des LncRNA

CD Genomics propose un service de séquençage lncRNA à haut débit et à coût réduit en combinant les derniers instruments de séquençage Illumina et une analyse bioinformatique avancée.

L'introduction du séquençage des LncRNA

Les ARN longs non codants (lncARN) sont définis comme une classe large et diversifiée d'ARN transcrits de taille supérieure à 200 nt qui n'encode pas de protéines. Les lncARN sont largement distribués dans les organismes et les transcrits de lncARN représentent la majeure partie du transcriptome non codant. Les lncARN peuvent être classés en différents sous-types (y compris les antisens, intergéniques, chevauchants, introniques, bidirectionnels et traités) en fonction de la position et de la direction de la transcription par rapport à d'autres gènes. Les lncARN ressemblent aux ARNm car ils sont généralement transcrits à partir de chromatine active, polyadénylés et coiffeés. Cependant, ils ne dirigent pas la synthèse des protéines.

Les lncARN jouent un rôle fonctionnel important pour les organismes et ne sont pas simplement le produit du bruit transcriptionnel. Une myriade de fonctions moléculaires des lncARN ont été découvertes chez les mammifères et les plantes, y compris le repositionnement des nucléosomes, le remodelage de la chromatine, le contrôle transcriptionnel et le traitement post-transcriptionnel. Les lncARN sont de plus en plus impliqués dans l'apparition de maladies, l'empreinte génomique et la régulation du développement. Le profilage de l'expression génique et in situ Les études d'hybridation ont révélé que l'expression des lncRNA est régulée au cours du développement, peut être spécifique à un tissu ou à un type cellulaire, et peut varier spatialement, temporellement ou en réponse à des stimuli.

L'application de séquençage de nouvelle génération La technologie a grandement facilité la découverte et l'analyse fonctionnelle des lncARN. Les informations de séquence des lncARN peuvent être acquises avec une résolution d'un seul nucléotide grâce à la préparation de bibliothèques, au séquençage à haut débit et à des outils puissants. bioinformatique analyse. Nous construisons la bibliothèque de séquençage par l'élimination de l'ARNr et conservons à la fois les lncARN et les ARN messagers. L'analyse des interactions lncARN-ARNm contribue à l'éclairage des réseaux régulateurs de lncARN.

Avantages du séquençage des LncRNA

• Identifie des caractéristiques connues et nouvelles.
• Permet le profilage des lncARN à travers une large gamme dynamique.
• Explore des biomarqueurs novateurs et des réseaux de régulation des lncARN.

Applications du séquençage des LncRNA

Le séquençage des lncRNA peut être utilisé pour, mais sans s'y limiter, les recherches suivantes :

• Découverte et prédiction de nouveaux lncARNs ;
• Enquête sur les maladies ;
• Analyse du Réseau Réglementaire.

Flux de travail de séquençage des LncRNA

Le flux de travail général pour le séquençage des lncRNA est décrit ci-dessous. Pour construire une bibliothèque de séquençage de lncRNA, la première étape du séquençage des lncRNA consiste à éliminer l'ARNr, suivie de la fragmentation de l'ARN, de la synthèse de cDNA, de la ligature des adaptateurs, de la sélection de taille et de l'enrichissement par PCR. Notre équipe d'experts hautement expérimentés met en œuvre une gestion de la qualité, en suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 2 μg, Quantité minimale : 500 ng, Concentration ≥ 50 ng/µl Cellules ≥ 2×106 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 100 mg OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Préparation de bibliothèque spécifique à un brin Illumina HiSeq PE150 ≥10 Go de données pour un petit génome et ≥12 Go pour un grand génome Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30.
	Analyse des données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données brutes et filtre de longueur Cartographie basée sur des références Prédiction de nouveaux transcrits (y compris les lncARN) Quantification et analyse d'expression différentielle des lncARN et des ARN messagers Classification de la famille des lncRNA et annotation fonctionnelle des lncRNA Appel SNP/InDel, identification des variants d'épissage Prédiction des cibles de lncRNA et analyse des interactions lncRNA-mRNA Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage des LncRNA pour votre rédaction (personnalisation)

Notre équipe de bioinformatique au niveau doctorat fournit une analyse complète des lncARN et des ARN messagers, permettant d'accéder aux informations sur les lncARN et les ARN messagers en une seule séquence. Nous pouvons vous aider dans la conception expérimentale dès le début de votre projet et offrir des consultations à chaque étape du processus du projet.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Graphique de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Quelles espèces sont appropriées pour les études de séquençage de lncRNA ?

Pour les études de séquençage de l'lncRNA, les espèces appropriées doivent répondre aux exigences suivantes : (i) eucaryotes ; (ii) au moins un génome de référence au niveau du squelette disponible ; (iii) annotations génomiques relativement complètes.

2. Pourquoi enlever l'ARNr lors de la construction de bibliothèques de séquençage de l'ARNlnc ?

L'ARN ribosomique (ARNr) est le composant le plus abondant de l'ARN total, représentant 80 % à 90 % des molécules dans un échantillon d'ARN total provenant d'animaux ou d'humains. Pour une détection efficace des transcrits, les ARNr très abondants doivent être éliminés avant le séquençage.

3. Comment prédire les cibles des lncRNA ?

Les deux analyses de co-localisation et de co-expression des ARN codants et des lncARN ont prouvé leur efficacité dans l'étude de la fonction potentielle des lncARN dans les processus biologiques et la prédiction des cibles des lncARN. Lorsque l'analyse de co-localisation prend en compte les gènes codants adjacents qui pourraient être des cibles des lncARN, l'analyse de co-expression considère les gènes co-exprimés comme des cibles probables des lncARN, indépendamment de leur localisation.

4. Quelles sont les différences entre lncRNA et mRNA ?

Les lncARN ressemblent ARNm car ils sont généralement transcrits à partir de chromatine active, polyadénylés et coiffés. Cependant, ils ne dirigent pas la synthèse des protéines. Certaines différences entre lncRNA et mRNA sont résumées dans le tableau ci-dessous.

Identification des longs ARN non codants enrichis dans les îlots contribuant à l'échec des cellules β dans le diabète de type 2.

Journal : Métabolisme Moléculaire
Facteur d'impact : 6,799
Publié : 23 août 2017

Résumé

Les auteurs ont identifié environ 1500 nouveaux lncARN, dont certains étaient exprimés différemment chez les souris obèses. Deux lncARN (βlinc2 et βlinc3) sont fortement enrichis dans les cellules β, corrélés à la prise de poids et aux niveaux de glycémie chez les souris obèses et modifiés chez les souris diabétiques db/db. De plus, l'expression de l'orthologue humain de βlinc3 a été modifiée dans les îlots de patients diabétiques de type 2, associée à l'IMC des donneurs. La modulation du niveau des deux lncARN par surexpression ou régulation à la baisse dans les cellules MIN6 et des îlots de souris a augmenté le nombre de cellules β mais n'a pas affecté la régulation de la glucose.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Analyse de séquençage de l'ARN

Le séquençage de l'ARN a permis d'identifier 1558 nouveaux lncARN, dont certains étaient exprimés de manière différentielle chez des souris obèses. L'annotation fonctionnelle a montré un enrichissement pour des voies biologiques liées à la localisation et au transport des protéines, aux processus redox, ainsi qu'au transport intracellulaire.

Figure 1. Aperçu des résultats de séquençage d'ARN. (A) Regroupement hiérarchique. Le rouge représente aucune distance et le jaune représente une distance plus longue. ND désigne un régime normal, HDR désigne les répondeurs au régime riche en graisses. (B) résumé des gènes différemment exprimés. (C) potentiel de codage pour les nouveaux transcrits ; (D) distribution de taille des gènes codants en protéines, lncRNAs connus et nouveaux. (E & F) Architecture des loci et isoformes de βlinc2 ou βlinc3.

2. Les niveaux d'expression de βlinc2 et βlinc3

Figure 2. Les niveaux d'expression de βlinc2 et βlinc3 sont modifiés dans les îlots de souris nourries avec un régime riche en graisses et chez les souris db/db.

Figure 3. Corrélations de l'expression de βlinc2 et βlinc3 avec le poids corporel et la glycémie des souris C57BL/6.

Figure 4. In vitro effets du glucose et du palmitate chroniquement élevés sur le niveau des deux lncARNs exprimés de manière différentielle dans les îlots de souris nourries avec un régime riche en graisses.

Figure 5. L'expression de βlinc3 est diminuée dans les îlots des donneurs atteints de diabète de type 2.

Figure 6. L'overexpression et la régulation à la baisse de βlinc2 et βlinc3 favorisent l'apoptose dans les cellules β MIN6. (A) Les cellules MIN6 ont été transfectées avec un vecteur de contrôle ou des plasmides pour induire l'overexpression de βlinc2 ou βlinc3. (B) Les cellules ont été transfectées avec un gapmer de contrôle ou un gapmer pour réduire l'expression de βlinc3. (C et D) sont l'expérience répétée dans des cellules d'îlots de souris dispersées. (E) Les cellules MIN6 ont été transfectées avec un plasmide exprimant p65 marqué par GFP.

Conclusion

Cet article a identifié un grand nombre de nouveaux lncARN. Au moins deux d'entre eux peuvent affecter la survie des cellules β et peuvent contribuer à la médiation glucolipotoxique des cellules β ainsi qu'à la manifestation et à la progression du T2D. Les lncARN peuvent donc constituer des cibles idéales pour la prévention et le traitement du diabète.

Référence :

1. Motterle A, Gattesco S, Peyot M L, et al.Identification des ARN longs non codants enrichis dans les îlots contribuant à l'échec des cellules β dans le diabète de type 2. Métabolisme moléculaire, 2017, 6(11) : 1407-1418.