Service de séquençage de microARN

Qu'est-ce que le séquençage des microARN ?

Le microARN (miARN) est une classe de petits ARN non codants endogènes chez les eucaryotes, d'une longueur d'environ 17 à 25 paires de bases. Depuis la découverte du miARN en 1993, les avancées et découvertes dans le domaine des petits ARN ont révolutionné la compréhension de la régulation génique au sein de la communauté scientifique. Du développement embryonnaire à l'apoptose cellulaire, en passant par la croissance tumorale, le miARN joue un rôle crucial dans une gamme de processus physiologiques et pathologiques. Divers miARN associés à la génétique, au métabolisme, aux maladies infectieuses et aux tumeurs offrent aux scientifiques de nouvelles perspectives pour la recherche pathologique et peuvent servir de biomarqueurs fiables pour les maladies. Les scientifiques explorent activement des interventions et des traitements thérapeutiques pour les maladies en manipulant les fonctions du miARN et en développant de nouvelles méthodes de délivrance in vivo. De plus, il a été découvert que le miARN médiatise l'évolution et l'adaptation entre espèces, et il reste encore beaucoup à explorer concernant le miARN.

la séquençage de miARN est un séquençage à haut débit méthode développée pour détecter l'expression des miARN. Drosha et Dicer, qui sont impliqués dans le traitement des miARN, appartiennent à la famille des nucléases RNase III. Par conséquent, les miARN possèdent un groupe 5' -PO4 et un groupe 3' -OH, qui peuvent être directement utilisés pour des réactions de ligation. De plus, les miARN se caractérisent par des longueurs de 18 à 30 nucléotides. Ainsi, en ligaturant directement l'ARN total et en récupérant les fragments insérés de longueurs variant de 18 à 30 nucléotides, les miARN peuvent être enrichis, des bibliothèques peuvent être construites et l'expression des miARN peut être analysée.

Notre service de séquençage de miARN :

CD Genomics s'applique séquençage à haut débit technologie pour séquencer des bibliothèques de microARN. Cette technologie permet l'acquisition de millions de séquences de microARN en une seule course, permettant une identification rapide des microARN connus et inconnus ainsi que de leurs différences d'expression dans différentes espèces, tissus, stades de développement et états pathologiques. De plus, le séquençage de nouvelle génération La technologie a des applications significatives dans la détection des brins complémentaires de microARN, l'édition de microARN, la détection des isoformes de microARN, la prédiction de nouveaux microARN et l'analyse des gènes cibles des microARN. Elle fournit un outil puissant pour étudier le rôle des microARN dans les processus cellulaires et leurs impacts biologiques.

Les services de séquençage de microARN de CD Genomics incluent la quantification des échantillons d'ARN total ou de microARN fournis par le client, suivie de la construction de bibliothèques de microARN, de la génération de clusters et du séquençage. Le service de séquençage de microARN de CD Genomics propose des services complets et intégrés, de l'extraction d'échantillons à l'analyse des données. Le service comprend le contrôle de qualité de l'extraction d'échantillons, la préparation de bibliothèques, le séquençage, l'analyse bioinformatique et le reporting des données.

Avantages de notre service de séquençage de miARN

• Haute sensibilité : Théoriquement capable de détecter une seule copie de microARN.
• Haute Précision : Capable de détecter des différences d'une seule base dans les microARN.
• Non affecté par l'interférence d'informations antérieures, capable d'identifier des microARN connus et de découvrir de nouveaux.
• Préserve les informations directionnelles pour l'analyse d'expression spécifique aux brins.
• Utilise des codes-barres pour analyser économiquement plusieurs échantillons en une seule fois.
• La plus haute sensibilité et le plus faible biais.
• Utilise des codes-barres moléculaires et des étiquettes numériques pour corriger les doublons faussement positifs introduits par la PCR et le séquençage.
• Équipe d'analyse bioinformatique solide fournissant des résultats d'analyse complets.

Applications du séquençage des miARN

• Utilisation autonome : Étudier l'expression des miARN pendant les processus biologiques.
• Utilisation autonome : Recherche de biomarqueurs miARN dans des fluides biologiques tels que le sérum, le plasma et les exosomes.
• Utilisation combinée avec séquençage d'ARNmConstruction de réseaux régulateurs miARN-mARN au cours des processus biologiques.
• Utilisation combinée avec séquençage circRNAConstruction de réseaux régulatoires miARN-circARN.
• Intégration multi-omiques : Construction de réseaux régulateurs circRNA-miRNA-mRNA.

Flux de travail de séquençage des miARN

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 5 µg, Concentration ≥ 200 ng/µl OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Bibliothèques de miARN (15-30 nt), petits ARN (30-200 nt) ou plage de taille personnalisée. Illumina HiSeq SE50 ≥ 10 M lectures Plus de 90 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse des données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données brutes et filtre de longueur Cartographie basée sur des références Classification et quantification des petits ARN Prédiction et annotation des gènes cibles Prédiction de nouveaux petits ARN Analyse des gènes cibles des petits ARN différemment exprimés (enrichissement GO et enrichissement KEGG) Remarque : Les données de sortie et les contenus d'analyse recommandés affichés sont uniquement à titre de référence. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse de données
• Détails sur le séquençage des microARN pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose des services de séquençage de microARN spécialisés, couvrant le contrôle de qualité des échantillons, la construction de bibliothèques, le séquençage approfondi et une analyse de données rigoureuse. Notre approche sur mesure garantit des résultats précis en accord avec vos besoins de recherche. Contactez-nous pour plus d'informations sur la manière dont nous pouvons soutenir vos objectifs de recherche.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

FAQ sur le séquençage des microARN

1. Pourquoi choisir de réaliser un séquençage de microARN ?

Le séquençage des microARN permet un profilage complet des niveaux d'expression de tous les microARN dans les cellules ou les tissus, y compris les microARN de faible abondance et rares. Par rapport aux méthodes traditionnelles telles que la RT-qPCR, il offre une sensibilité et une couverture supérieures. Cela est crucial pour étudier les relations entre les microARN et les maladies, les processus biologiques et les réponses aux médicaments.

2. Quel est le processus de construction de la bibliothèque pour le séquençage des microARN ?

Le microARN (miARN) se distingue de l'ARN messager (ARNm), de l'ARN non codant long (ARNnc) et de l'ARN circulaire (ARNc) par ses courtes séquences. Par conséquent, lors de la construction de la bibliothèque, les caractéristiques uniques des séquences de miARN sont directement utilisées en ajoutant des adaptateurs, suivis d'une transcription inverse et d'une amplification. Ensuite, des adaptateurs de séquençage sont ajoutés par amplification PCR, suivie d'une purification par gel des fragments d'ADN spécifiques. Ensuite, la bibliothèque est séquencée sur la machine. En raison du processus distinct de construction de la bibliothèque, la détection simultanée de miARN et d'ARNm nécessite la construction de bibliothèques séparées. Cela est dû au fait que la sélection de segments dans le processus de construction de la bibliothèque liée à l'ARNm, à l'ARNnc et à l'ARNc filtre les petits fragments d'ARN.

3. Qu'est-ce que la séquence de graine de miARN ?

La séquence de graine d'une molécule de miARN fait référence à un segment crucial généralement composé de 2 à 8 nucléotides. Située à l'extrémité 5' de la molécule de microARN, cette séquence joue un rôle clé dans la liaison à la région 3' UTR des gènes cibles. En s'appariant de manière complémentaire avec le gène cible via sa séquence de graine, le miARN module l'expression génique.

4. Quelle est la durée du séquençage des microARN ?

La longueur du séquençage des microARN varie en fonction de la plateforme de séquençage et du design expérimental utilisé. En général, les lectures générées lors du séquençage des microARN varient typiquement de 18 à 50 nucléotides, soumises aux contraintes techniques de l'instrument de séquençage et aux objectifs spécifiques de l'expérience de séquençage.

5. Quelles sont les méthodes de détection des miARN ?

Les méthodes de détection des miARN comprennent le séquençage profond, les microarrays et la qPCR en temps réel. Le séquençage profond est à la pointe de la technologie. séquençage à haut débit technologie qui permet une analyse complète, approfondie et détaillée d'une entité biologique, d'un tissu ou d'un composant cellulaire au niveau du génome, du transcriptome ou du métabolome. Grâce à la technologie de séquençage profond, des miARN inconnus peuvent être explorés et découverts, et des miARN connus peuvent être analysés préliminairement de manière qualitative et semi-quantitative. Micro-array La technologie offre des avantages en termes de débit élevé et de rentabilité, mais a des capacités d'expression différentielle limitées. La qPCR en temps réel est la méthode de quantification des miARN la plus sensible et la plus précise pour déterminer le nombre de copies d'ADN (ou d'ADNc) dans un échantillon.

6. Quels avantages le séquençage des microARN offre-t-il par rapport à la RT-qPCR traditionnelle ?

Le séquençage des microARN présente des avantages significatifs par rapport à la RT-qPCR traditionnelle : il détecte de manière exhaustive tous les microARN connus et potentiels, y compris ceux à faibles niveaux d'expression ; il facilite le traitement à haut débit de plusieurs échantillons, améliorant ainsi l'efficacité du travail et la cohérence des données ; de plus, il offre des analyses bioinformatiques détaillées, y compris des analyses d'expression différentielle et d'enrichissement fonctionnel, aidant à une compréhension plus approfondie des rôles et des mécanismes des microARN dans les processus biologiques.

Études de cas sur le séquençage des microARN

biomarqueurs miARN pour prédire les résultats de survie globale dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou

Journal : Génomique
Facteur d'impact : 6,205
Publié : 2020

Contexte

Le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) est une tumeur maligne du tractus digestif supérieur. Les altérations de la fonction des miARN peuvent favoriser le développement du cancer par divers mécanismes. Cette étude a utilisé Séquençage de l'ARN (RNA-seq) et des données de séquençage de miARN provenant de la base de données TCGA pour démontrer le microenvironnement de miARN dysrégulé et fournir des biomarqueurs précieux pour la thérapie par miARN. Dans l'ensemble d'entraînement, sept miARN ont été identifiés comme des facteurs pronostiques indépendants pour les patients atteints de HNSCC. Ces miARN ciblaient collectivement 60 gènes, parmi lesquels neuf gènes cibles (CDCA4, CXCL14, FLNC, KLF7, NBEAL2, P4HA1, PFKM, PFN2 et SEPPINE1) étaient associés à la survie globale (SG) des patients. Cette étude a identifié de nouveaux marqueurs de miARN pour prédire le pronostic du carcinome épidermoïde de la tête et du cou.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Acquisition de données

Les données RNA-seq et miRNA-seq des patients atteints de HNSCC ont été téléchargées à partir de la base de données TCGA. La base de données miRBase contient des séquences et des annotations de miRNA connus, y compris des informations sur l'emplacement et la séquence des miRNAs matures. Les séquences au format Fasta de toutes les séquences de miRNA matures obtenues à partir de miRBase ont été utilisées pour l'annotation des miRNA. Les données RNA-seq et miRNA-seq ont été extraites d'échantillons de 529 individus (42 normaux et 487 tumeurs) et 552 individus (44 normaux et 508 tumeurs), respectivement. Les données cliniques et pathologiques collectées simultanément comprenaient le sexe, l'âge, le stade, la classification TNM, l'état de survie et les jours de survie.

2. Établissement de la prognostique basée sur les miARN

Marqueurs Un total de 1 075 ARNm exprimés de manière différentielle (581 régulés à la hausse et 494 régulés à la baisse) et 313 miARN exprimés de manière différentielle (203 régulés à la hausse et 110 régulés à la baisse) ont été obtenus à partir de l'analyse des données omiques du TCGA. Les figures 1A-1B montrent les cartes thermiques et les diagrammes en volcan des 20 ARNm exprimés de manière différentielle les plus régulés à la hausse/à la baisse, tandis que les figures 1C-1D montrent les cartes thermiques et les diagrammes en volcan des 20 miARN exprimés de manière différentielle les plus régulés à la hausse/à la baisse. Pour sélectionner les miARN pronostiques, les miARN exprimés de manière différentielle ont été évalués à l'aide d'une analyse de Cox univariée. Dans l'analyse de Cox univariée, 26 miARN importants avec des changements significatifs ont été identifiés, parmi lesquels sept miARN exprimés de manière différentielle (hsa-miR-499a-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-4746-5p, hsa-miR-432-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-137-3p) ont été identifiés comme des facteurs pronostiques indépendants pour les patients atteints de HNSCC. Par conséquent, la formule du modèle dans cette étude est : Score de Risque = (0,238 × hsa-miR-337-3p) + (0,246 × hsa-miR-99a-5p) - (0,232 × hsa-miR-4746-5p) - (0,233 × hsa-miR-432-5p) - (0,261 × hsa-miR-142-3p). De plus, les scores de risque pour chaque patient du groupe d'étude ont été calculés. Ensuite, le score de risque médian a été utilisé comme valeur seuil pour diviser les patients en groupes à haut risque et à faible risque dans l'ensemble d'entraînement, l'ensemble de test et tous les patients.

Fig. 1. Le graphique en volcan et la carte thermique des 20 gènes ou miARN différemment exprimés les plus régulés à la hausse/à la baisse. A-B : ARN messager ; C-D : miARN.

3. Résultats de survie et analyse multivariée

Dans cette étude, l'expression de sept miARN dans la survie des patients a été analysée à l'aide de courbes de survie KM. Il a été constaté que hsa-miR-499a-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-4746-5p, hsa-miR-432-5p, hsa-miR-142-3p et hsa-miR-137-3p influençaient significativement les résultats de survie globale (SG) (Figures 2A-G). De plus, des courbes de survie KM pour les deux ensembles de données ont été utilisées pour évaluer la valeur prédictive des sept miARN. Dans l'ensemble d'entraînement et l'ensemble de test, les patients du groupe à haut risque avaient des taux de survie plus bas que ceux du groupe à faible risque. Une analyse de la courbe ROC a été réalisée pour déterminer si les motifs d'expression des miARN associés à la survie pouvaient fournir une prédiction précoce de l'apparition du HNSCC. Les résultats ont montré une AUC de 0,716 pour l'ensemble d'entraînement et une AUC de 0,654 pour l'ensemble de test, indiquant une sensibilité et une spécificité modérées du modèle pronostique. Le graphique de l'état de survie par risque a démontré qu'à mesure que le score de risque du patient augmentait, le taux de mortalité augmentait également (Figure 3). Pour établir un modèle pronostique basé sur les sept miARN, des analyses de Cox univariée et multivariée ont été réalisées pour identifier les facteurs de risque. Les résultats ont révélé qu'en fonction des sept caractéristiques de miARN, le sexe et le stade N étaient des facteurs pronostiques indépendants pour la SG (Figure 4).

Fig. 2. Analyse de la survie globale de 7 miARN, l'ensemble d'entraînement et l'ensemble de test. A-G : miARN ; H : Ensemble d'entraînement ; I : Ensemble de test.

Fig. 3. Les résultats des courbes ROC et du statut de survie des patients dans l'ensemble d'entraînement et l'ensemble de test. A : ROC dans l'ensemble d'entraînement ; B : ROC dans l'ensemble de test ; C : Statut de survie dans l'ensemble d'entraînement ; D : Statut de survie dans l'ensemble de test.

Fig. 4. Analyse COX univariée et multivariée pour identifier les facteurs de risque. A : Univariée ; B : Multivariée.

4. Analyse des gènes cibles des miARN

La prédiction des gènes cibles pour ces sept miARN a abouti à 60 gènes cibles obtenus à partir de bases de données en ligne. Les connexions potentielles entre les miARN et les gènes cibles ont été explorées à l'aide de Cytoscape. Comme le montre la Figure 5, hsa-miR-137-3p était le plus grand nœud du réseau, tandis que hsa-miR-99a-5p et hsa-miR-4746-5p n'avaient pas de gènes cibles correspondants (les nœuds rouges représentent les gènes surexprimés, les nœuds verts représentent les gènes sous-exprimés). Pour évaluer les fonctions biologiques de ces gènes cibles, des analyses d'enrichissement GO et des analyses de voies KEGG ont été réalisées. L'analyse GO a révélé un enrichissement des gènes cibles dans des processus biologiques (BP) tels que la régulation négative des processus cellulaires, le développement des tissus et la réponse aux facteurs inhibiteurs. Les fonctions moléculaires (MF) étaient enrichies en constituants de la matrice extracellulaire, en liaison avec des facteurs de croissance, en liaison avec l'actine et en activité de phosphatase protéique tyrosine/sérine/thréonine. Les composants cellulaires (CC) étaient principalement enrichis en granules alpha plaquettaires, en kinétochores de chromosomes condensés, en matrice extracellulaire et d'autres termes. L'analyse des voies KEGG a indiqué que ces gènes cibles étaient principalement enrichis dans la voie des pentoses phosphates, le métabolisme du galactose et les voies de glycolyse/gluconéogenèse (Figure 6).

Fig. 5. Cytoscape a exploré le lien potentiel entre les microARN et les gènes cibles.

Fig. 6. Les résultats de l'analyse GO et de l'analyse KEGG des gènes cibles.

5. Relation entre les miARN

Gènes Cibles et Résultat de Survie En analysant l'impact de l'expression des gènes cibles des miARN sur la survie des patients, il a été constaté que l'expression de neuf gènes : CDCA4, CXCL14, FLNC, KLF7, NBEAL2, P4HA1, PFKM, PFN2 et SEPPINE1, influençait significativement la survie globale (SG) (Figures 7A-7I). La construction d'un réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) a révélé deux gènes clés centraux, PDGFRB et RAD51 (Figure 7J).

Fig. 7. Analyse de la survie globale des gènes cibles identifiés et du réseau d'interaction protéine-protéine (PPI). A-I : ARN messager ; J : réseau PPI.

Conclusion

Cette étude, basée sur le jeu de données TCGA, a identifié une caractéristique innovante de miARN et analysé le pronostic du HNSCC. La recherche fournit de nouvelles perspectives pour le développement d'outils fiables pour la prédiction précise des résultats des traitements du cancer. Cependant, les limites de cette étude incluent le manque de validation dans des échantillons cliniques et une taille d'échantillon relativement petite, ce qui peut limiter la puissance statistique. Les marqueurs moléculaires identifiés devraient être validés dans davantage d'études indépendantes et d'expériences fonctionnelles.

Référence :

1. Wu Z H, Zhong Y, Zhou T, et al.Biomarqueurs miARN pour prédire les résultats de survie globale dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou. Génomique, 2021, 113(1) : 135-141.