Résumé des méthodes de détection des effets hors cible de CRISPR-Cas9

La technologie d'édition du génome se trouve à la pointe de la recherche actuelle en sciences de la vie. Cependant, pour sa traduction réussie en applications cliniques, l'exactitude détection des effets hors cible est indispensable. Évaluer et atténuer correctement les effets hors cible est une préoccupation pressante. La question des effets hors cible dans la technologie d'édition génétique CRISPR-Cas9 a été un sujet d'attention de longue date. Il existe deux approches principales pour examen des effets hors cible de CRISPR-Cas9méthodes de simulation computationnelle et méthodes de séquençage ^[1].

Méthodes de séquençage pour la détection des effets hors cible de CRISPR-Cas9

Séquençage du génome entier (SGE)

Le séquençage de génome complet (WGS) est associé à un biais d'évaluation minimal dans le contexte de l'évaluation des mutations hors cible induites par Cas9. Actuellement, des profondeurs de séquençage de 30 à 60x sont généralement utilisées. Cependant, le coût du WGS est élevé, et avec des profondeurs de séquençage plus faibles, seul un petit nombre de clones peut être séquencé, ce qui pourrait faire manquer la majorité des événements hors cible à faible fréquence. Pour l'analyse in vivo, le WGS reste la méthode préférée, mais des techniques qui capturent directement les cassures double brin (DSBs), telles que BLESS, pourraient offrir des capacités supérieures par rapport au WGS. Cela est dû au fait que le WGS peut également capturer des variations naturellement présentes entre les modèles cellulaires/animaux, ce qui pourrait compliquer l'analyse et conduire à des résultats trompeurs.

Dans l'analyse du WGS, le choix de groupes témoins appropriés est particulièrement crucial. Pour minimiser les faux positifs et négatifs dans le WGS, l'analyse nécessite souvent la mise en place de plusieurs groupes, ce qui peut être à la fois laborieux et coûteux.

Chip-Seq

Les nucléases Cas, une classe de protéines, peuvent être soumises à une méthode de capture par anticorps suivie de séquençage, connue sous le nom de ChIP-Seq. Le ChIP-Seq est couramment utilisé dans le contexte de la détection des effets hors cible associés à dCas9. Contrairement à la Cas9 conventionnelle, qui sectionne la séquence cible, entraînant sa dissociation de la séquence d'ADN et un lien instable, dCas9, caractérisé par une activité nucléase altérée, conserve la capacité de se lier à la séquence cible guidée par l'ARNg. En conséquence, dCas9 est fréquemment appliqué pour l'activation CRISPR (CRISPRa) afin d'augmenter l'expression génique plutôt que pour l'élimination de gènes.

DISCOVER-seq, également connu sous le nom de MRE11 ChIP-Seq, est une méthode récemment développée pour le séquençage des effets hors cible du CRISPR-Cas9. Cette approche s'appuie sur le recrutement du facteur de réparation de l'ADN endogène MRE11 pour identifier les cassures double brin induites par Cas sur l'ensemble du génome. Au cours du processus de réparation de l'ADN, MRE11 est précisément recruté sur le site de survenue des DSB. Par conséquent, grâce à l'extraction des sites liés à MRE11 et au séquençage à haut débit, cette méthode permet d'examiner simultanément les occurrences sur cible et hors cible. Il est important de noter que DISCOVER-seq est applicable à la fois aux échantillons in vivo et in vitro.

discover-seq

Séquençage de l'enrichissement des sites de clivage de la nucléase Cas et des sites de DSB

La méthode de séquençage qui repose sur l'enrichissement des régions liées ou clivées par des nucléases Cas est communément appelée approche de détection non biaisée. Suivant ce raisonnement, des méthodes d'enrichissement ont été conçues, y compris :

(1) Précipitation par anticorps :

Comme le Chip-Seq, où des anticorps sont utilisés pour capturer les régions cibles.

Enrichissement des sites de clivage de la nucléase Cas :

Digenome-Seq, abréviation de séquençage de génome entier digéré par Cas9 in vitro. Après la coupure par Cas9, un groupe phosphate 5' reste, ce qui permet la ligation d'adaptateurs pour l'amplification par PCR et le séquençage NGS ultérieur. Dans Digenome-Seq, l'ADN génomique purifié (ADNg) est traité avec Cas9 in vitro, suivi de la ligation d'adaptateurs et d'un séquençage complet du génome entier. Cette méthode est adaptée aux échantillons in vitro.

(3) Enrichissement des régions de cassures double brin de l'ADN (DSB) - Capture des DSB :

Dans BLESS-Seq, un enrichissement par affinité biotine directe est utilisé pour capturer les fragments de DSB guidés par CRISPR-Cas9, qui peuvent ensuite être séquencés après ligature d'adaptateurs. L'enrichissement par affinité biotine capture spécifiquement les DSB qui se produisent activement, laissant de côté les DSB déjà réparés, ce qui lui vaut le label de "snapshot hors cible". Cette méthode est couramment appliquée aux échantillons cellulaires et tissulaires.

Dans IDLV-Seq, le vecteur lentiviral déficient en intégration (IDLV) peut être utilisé comme ancre PCR pour amplifier les sites de DSB générés par la jonction non homologue (NHEJ). Cela permet la détection des sites hors cible. Cependant, l'efficacité de cette méthode dépend de la capacité de l'IDLV à s'intégrer dans les DSB via la NHEJ. De plus, en raison des caractéristiques d'intégration aléatoire des lentivirus, il existe une possibilité de faux positifs.

HTGST est adapté pour détecter les translocations chromosomiques induites par CRISPR-Cas9, mais il convient de noter que les événements hors cible induits par CRISPR-Cas9 résultent principalement en indels, qui sont relativement moins fréquents. De plus, cette méthode est toujours soumise à des limitations imposées par l'accessibilité de la chromatine.

méthode impartiale

Comparées aux méthodes qui enrichissent les sites de coupure des nucléases, les méthodes de capture des DSB sont plus pertinentes sur le plan physiologique. Cependant, elles peuvent présenter une efficacité inférieure puisque la plupart des DSB sont de très courte durée. Le marquage in vivo des IDLV et la ligation des linkers in situ peuvent tous deux être potentiellement influencés par la composition locale de la chromatine et des séquences près du site de coupure. Par conséquent, les méthodes de capture peuvent être sujettes à des biais.

Résumé des méthodes de séquençage

De nombreuses méthodes de séquençage sont disponibles, rendant impossible de fournir des descriptions exhaustives de chacune. Le tableau présenté ci-dessous offre la compilation la plus complète actuellement accessible. Étant donné les informations fournies précédemment, il n'est pas possible de déterminer de manière définitive la méthode supérieure. Le choix de la technique de séquençage la plus appropriée devrait être guidé par les besoins spécifiques de l'expérience et les ressources financières à la disposition de l'équipe de recherche.

Méthodes de simulation computationnelle pour la détection des effets hors cible de CRISPR-Cas9

Ces techniques ont pour but de prédire les séquences potentielles hors cible, principalement en raison soit de la similarité entre les séquences cibles et d'autres séquences, soit de la spécificité limitée des ARN guides (gARN). Les séquences potentielles hors cible peuvent être déduites en intégrant des données expérimentales ou en utilisant des algorithmes informatiques. Pour valider les effets hors cible, on recourt généralement au séquençage de produits PCR. Ces approches sont souvent qualifiées de "biaisées", et le fonctionnement des outils de prédiction hors cible peut être classé en deux mécanismes principaux : (1) des modèles basés sur l'alignement de séquences et (2) des prédictions reposant sur un scoring basé sur des algorithmes. ^[1].

À mesure que l'utilisation de la technologie CRISPR se généralise, les attentes concernant son application augmentent également. Souvent, lors de l'utilisation de la technologie CRISPR, les conceptions expérimentales peuvent manquer de l'inclusion de groupes de contrôle supplémentaires, ce qui pourrait poser des défis dans les expériences ultérieures. Par conséquent, il est conseillé d'effectuer rapidement une analyse des effets hors cible après avoir utilisé CRISPR pour l'édition génique ou de conserver des échantillons en phase précoce. Les cellules et les animaux sont tous deux susceptibles aux mutations spontanées.

Références :

1. Naeem, Muhammad et al. Dernières stratégies développées pour minimiser les effets hors cible dans l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas. Volume des cellules. 2020
2. Ipek Tasan et Huimin Zhao. Ciblage de la spécificité du système CRISPR/Cas9.ACS Biologie Synthétique 2017 
3. Wienert, B., Wyman, S.K., Yeh, C.D. et al. Détection des cibles hors cible de CRISPR avec DISCOVER-seq. Nat Protoc 15, 1775–1799 (2020)