Séquençage de nouvelle génération : Validation de votre modification CRISPR/Cas9

Qu'est-ce que la technologie CRISPR/Cas9 ?

La technologie CRISPR/Cas9 est l'une des méthodes les plus populaires utilisées pour l'édition du génome en introduisant à la fois l'endonucléase Cas9 et un ARN guide dans les cellules d'intérêt. L'ARN guide est conçu pour diriger l'endonucléase Cas9 vers un site particulier dans le génome où elle produit une cassure double brin (CDB). Il existe généralement deux façons de réparer la cassure double brin : la jonction non homologue des extrémités (NHEJ) ou la réparation dirigée par homologie (HDR). La NHEJ est la principale forme de réparation dans les cellules mammifères. Étant donné qu'elle est sujette aux erreurs, la réparation par la voie NHEJ permet des insertions, des délétions et des mutations de perte de fonction qui entraînent probablement des décalages de lecture et affectent l'expression des protéines. En plus des mutations de knockout, un ADN modèle peut être introduit pour diriger la HDR et créer des mutations dans le gène d'intérêt. La HDR copie fidèlement la séquence modèle vers le site cible coupé.

Figure 1. L'édition génomique par la technologie CRISPR/Cas9 est réalisée par réparation.

Comment utiliser le NGS pour la validation de l'édition génomique

Bien que le système CRISPR soit efficace pour l'édition du génome, certaines cellules dans une population ne seront pas modifiées, certaines auront un allèle modifié et certaines auront les deux allèles modifiés. Il est important de valider les modifications génomiques après les expériences CRISPR/Cas9. Séquençage de nouvelle génération (NGS), en tant qu'approche puissante et à haut débit, peut être utilisée pour le dépistage des mutations induites par CRISPR. NGS peut simultanément examiner des changements hors cible dans un grand nombre d'échantillons. Lors de l'utilisation de cette méthode, il est nécessaire de conserver un ensemble de cellules de contrôle. Des logiciels tels que CRISPResso peuvent être utilisés pour l'analyse des données. NGS est également adapté pour évaluer les modifications génomiques créées par ZFN (nuclease à doigt de zinc) ou TALEN (nuclease à effet d'activateur de transcription similaire).

Sentmanat et al. (2018) a décrit le NGS approche pour la validation des modifications génomiques dans son travail publié. En bref, Séquençage CRISPR implique un protocole de PCR en deux étapes et un séquençage profond. Tout d'abord, le site génomique cible d'intérêt est amplifié avec un amorce contenant des adaptateurs de séquençage Illumina partiels. Ensuite, une seconde PCR est réalisée avec des amorces contenant des indices et les adaptateurs de séquençage Illumina nécessaires. En conséquence, les régions cibles seront amplifiées. Les produits PCR qualifiés sont ensuite soumis à un séquençage profond sur la plateforme Illumina MiSeq.

NGS les techniques de validation englobent plusieurs approches clés :

Séquençage du génome entier (SGE) se distingue comme une méthode complète pour discerner les changements génomiques induits par CRISPR/Cas9. En séquençant l'ensemble du génome, WGS offre une couverture inégalée pour identifier les insertions, les suppressions et d'autres modifications. Cette technique est essentielle pour évaluer l'efficacité de l'édition CRISPR/Cas9, tout en révélant des mutations rares au sein du génome.

Le séquençage d'amplicons ciblés, en revanche, se concentre sur des régions génomiques spécifiques, y compris les sites cibles CRISPR/Cas9 et les zones voisines. Avec sa grande profondeur de couverture, cette technique excelle dans la détection de mutations minutieuses, servant d'outil précieux pour corroborer la précision des modifications CRISPR/Cas9. Particulièrement bénéfique pour évaluer les modifications dans des gènes individuels ou un ensemble limité de cibles.

L'analyse des off-target est essentielle pour prédire et séquencer les sites potentiels off-target générés par les modifications CRISPR/Cas9. Cette méthode aide à évaluer la spécificité et la sécurité des modifications CRISPR/Cas9 en identifiant les altérations non intentionnelles. Elle joue un rôle crucial dans l'évaluation de la précision et des profils de sécurité des méthodologies d'édition CRISPR/Cas9.

La PCR à long rayon et le séquençage adoptent une approche complémentaire en amplifiant de grandes régions génomiques entourant les sites cibles de CRISPR/Cas9 avant le séquençage. Cette méthode est efficace pour capturer les variations structurelles et les réarrangements chromosomiques résultant des manipulations CRISPR/Cas9. Elle s'avère être un outil précieux pour détecter des changements génomiques substantiels induits par les procédures d'édition CRISPR/Cas9.

Figure 2. Activité de CRISPR-Cas9 rapportée avec le test T7E1 et le séquençage de nouvelle génération. (Sentmanat et al., 2018)

Comment les mutations hors cible sont-elles détectées ?

Une autre limitation de la technologie CRISPR est la survenue de coupures hors cible. Le système CRISPR ne coupe pas seulement à son endroit cible, mais aussi à des sites non intentionnels avec des séquences similaires. Ces coupures hors cible peuvent produire des mutations indésirables et même nuisibles. Au cours des dernières années, les scientifiques ont établi plusieurs NGSapproches basées sur la détection des mutations hors cible.

Tableau 1. Approches basées sur le NGS pour détecter les mutations hors cible.

Références :

1. Yan W X, Mirzazadeh R, Garnerone S, et al. BLISS est une méthode polyvalente et quantitative pour le profilage à l'échelle du génome des cassures double brin de l'ADN. Communications Nature, 2017, 8 : 15058.
2. Sentmanat M F, Peters S T, Florian C P, et al. Une enquête sur les stratégies de validation pour l'édition CRISPR-Cas9. Rapports scientifiques, 2018, 8(1) : 888.
3. Frock R L, Hu J, Meyers R M, et al. Détection à l'échelle du génome des cassures double brin de l'ADN induites par des nucléases conçues. Biotechnologie de la nature, 2015, 33(2) : 179.
4. Cameron P, Fuller C K, Donohoue P D, et al. Cartographie du paysage génomique de la coupure par CRISPR–Cas9. Méthodes de la nature, 2017, 14(6) : 600.
5. Kim D, Bae S, Park J, et al. Digenome-seq : profilage à l'échelle du génome des effets hors cible de CRISPR-Cas9 dans les cellules humaines. Méthodes Nat, 12:237-43, 2015.
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