Directives de préparation d'échantillons pour le séquençage de cellules uniques

La norme de cellule de haute qualité pour le séquençage.

Nombre total de cellules : > 1×10⁵ cellules

Un nombre de cellules faible n'est pas suffisant pour un contrôle de qualité précis, et un contrôle de qualité inexact peut facilement entraîner des problèmes de qualité des données de séquençage.

Concentration cellulaire : 700-1200 cellules/µl

Assurez-vous qu'un certain volume de cellules de haute qualité puisse être utilisé dans la machine, et que la concentration des comptages répétés ne fluctue pas de plus de ±100 cellules/µl.

Diamètre de la cellule ≤ 5 µm, diamètre de la cellule cible < 40 µm

Il est recommandé d'utiliser des filtres à cellules avec une taille de pore de 40 µm ou moins pour éliminer les débris cellulaires et les cellules agglomérées, tandis que de petits diamètres cellulaires augmentent le taux de multicellularité et que de grands diamètres cellulaires ont tendance à avoir des pores obstrués ou une faible efficacité de capture.

Viabilité cellulaire ≥85%

La viabilité cellulaire est un indicateur de référence important pour refléter l'intégrité de l'ARN, car les cellules avec des dommages importants ou une dissociation excessive ne reflètent pas bien l'intégrité de l'ARN. Ainsi, plus la viabilité cellulaire est élevée, en principe, mieux c'est.

Condition de suspension : utiliser du PBS ou un milieu de culture sans Ca.²⁺, Mg²⁺, EDTA pour une résuspension complète

Lavez deux fois avec DPBS et 0,04 % de BSA. La suspension cellulaire doit minimiser l'agglutination des cellules, les débris cellulaires excessifs, la présence de gros débris ou la présence d'autres impuretés. Pas de métal Ca.²⁺, Mg²⁺L'EDTA et d'autres substances affectant l'activité de la transcriptase inverse sont présentes dans la résuspension cellulaire à bord.

Diamètre de la cellule ≤ 5 µm, diamètre de la cellule cible < 40 µm

Il est recommandé d'utiliser des filtres à cellules avec une taille de pore de 40 µm et inférieure pour éliminer les débris cellulaires et les cellules agglomérées. De petits diamètres cellulaires augmentent le taux de multicellularité, tandis que de grands diamètres cellulaires ont tendance à avoir des pores obstrués ou une faible efficacité de capture.

Collecte d'échantillons de tissus

1. Tissu frais : taille d'échantillon ≥ 0,2 g
2. Tissu perforé : pas moins de 2 bandes (diamètre ≥ 1,5 mm, longueur 1,5 cm)
3. Taille d'échantillon très petite : s'il vous plaît contacter le support technique, en fonction de la lésion de l'échantillon, de la méthode d'échantillonnage et des conditions d'envoi pour donner des conseils raisonnables.
4. Remarques sur la collecte d'échantillons de tissu

• Échantillonnage cohérent : Le statut de collecte des échantillons des groupes expérimental et témoin doit être aussi similaire que possible.
• Échantillonnage précis : Retirer les tissus non ciblés, tels que l'excès de graisse et l'enveloppe, et laver pour éliminer les résidus de sang.
• Maintenez l'échantillon humide : transférez l'échantillon dans une solution de préservation des tissus dès que possible après le prélèvement. Les échantillons exposés à l'air pendant une longue période sont sujets à la déshydratation et à la mort des cellules à la surface des tissus. Pour les tissus de petit diamètre, une exposition prolongée peut directement entraîner des échantillons ne parvenant pas à obtenir une suspension suffisante de cellules uniques. Des exemples incluent les échantillons par ponction, le prélèvement par forceps de biopsie de tissus granuleux de petit diamètre.
• Éviter la défiguration : Éviter la contamination chimique et les dommages thermiques. Si l'utilisation d'un couteau laser, d'un couteau électrique et d'autres outils de collecte d'échantillons est inévitable, la partie endommagée thermiquement doit être retirée ; le prélèvement de biopsie est préférable lorsqu'il est effectué en gros morceaux chaque fois que l'échantillon est maintenu pour réduire les dommages cellulaires et les effets irréversibles sur les expériences ultérieures.

Des échantillons de tissu frais doivent être complètement immergés dans une solution de préservation des tissus pré-refroidie à 2-8°C.

Préparation d'échantillons cellulaires

1. PBMC cellules mononucléées du sang périphérique

• Les cellules PBMC dans le sang sont généralement isolées par centrifugation sur gradient de densité de Ficoll.
• Si le séquençage de cellules uniques ne peut pas être effectué immédiatement, après avoir extrait les PBMC en bon état, vous pouvez choisir de les envoyer après les avoir congelés.

2. Culture de cellules

• Les cellules encapsulées sont généralement dissociées par digestion avec de l'enzyme Trypsine-EDTA à 0,25 % ; les lignées cellulaires fragiles sont traitées avec une collagénase légèrement plus faible pour garantir efficacement la viabilité cellulaire ; les cellules en suspension peuvent être mélangées directement par un soufflage doux de la suspension cellulaire. Lavez les cellules par resuspension avec du PBS contenant 5 % de FBS ou 0,05 % de BSA (ou un milieu conventionnel).
• Placez à 2-8°C et effectuez le séquençage de cellules uniques sur la machine dans les 2 heures. Pour les cellules qui doivent être transportées ou préservées, elles peuvent être lyophilisées.

3. Congélation des cellules

• La normalisation de la congélation des cellules a un impact considérable sur la qualité de la congélation des cellules, et la procédure de congélation en gradient doit être strictement respectée.
• 1×10⁶-10⁷ Les cellules sont resuspendues dans 1 mL de solution de lyophilisation cellulaire, transférées dans des tubes de lyophilisation spirale externes, programmées pour refroidir à -80 °C, et transférées dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme. Les cellules congelées peuvent être réactivées pour des expériences, veuillez consulter nos experts techniques pour plus de détails.

Préparation d'échantillons d'organoïdes

Les organoïdes sont généralement cultivés dans un gel matriciel composé de matrice extracellulaire, contenant un peu de laminine, de collagène, de facteurs de croissance, etc., qui peut être dissous dans un liquide à 4°C et peut être re-solidifié à 37°C, fournissant un microenvironnement important et un soutien tissulaire pour la croissance cellulaire dans l'espace.

Préparation d'échantillons spéciale

• Cellule fragile : la nucléation directe est recommandée pour obtenir des suspensions à nucléation unique.
  Pour les tissus cellulaires fragiles, tels que les cellules parenchymateuses du foie ou les adipocytes matures, qui sont sujets à la rupture et possèdent des cellules plus grandes, il est difficile d'obtenir une suspension de cellules uniques avec un pourcentage élevé de cellules cibles par digestion enzymatique. Il est recommandé de nucléer directement le tissu pour obtenir une suspension de cellules nucléées uniques.
• Teneur élevée en matières grasses : la nucléation est recommandée.
  Pour les tissus ayant une forte teneur en graisses, la densité lipidique est faible, ce qui les maintient dans un état flottant ou suspendu lors de la dissociation et de la centrifugation, rendant leur descente difficile (sauf pour les adipocytes immatures). Les adipocytes matures sont facilement éliminés après centrifugation, en éliminant le surnageant et en les collectant à travers un tamis, seuls quelques adipocytes immatures peuvent couler et s'enrichir lors de la centrifugation et être capturés par la machine, mais leur pourcentage est limité.
• Hétérotypes cellulaires : l'aspiration du noyau est recommandée pour obtenir des suspensions nucléaires de cellules uniques.
  Pour les tissus avec des hétérotipes cellulaires, tels que le muscle, le cœur, le cerveau et les nerfs, le diamètre des cellules est trop grand pour passer à travers la puce microfluidique, ce qui peut facilement provoquer un blocage des canaux de la puce et un échec de la génération de microgouttes. Il est donc recommandé de choisir l'extraction des noyaux pour obtenir des données de séquençage de noyaux de cellules uniques.
• Facile à dégrader : éviter les lavages excessifs et ne pas transporter sur de longues distances.
  Pour les échantillons qui se dégradent facilement par eux-mêmes, tels que le pancréas (fluide enzymatique auto-sécrété) et l'intestin de souris (l'intestin contient des enzymes alimentaires digestives), il convient de veiller à éviter un lavage excessif et d'essayer de ne pas les transporter sur de longues distances, et de les digérer sur la machine dès que possible.
• Tissu fortement endommagé ou malade : contenir le tissu environnant pour protection.
  Il est important de prendre en compte les besoins du sujet et de s'assurer que le tissu est en bon état (par exemple, les tissus cibles très endommagés ou malades nécessitent souvent un volume de tissu plus important, y compris le tissu de la zone environnante pour protection).
• Échantillons animaux non modèles
  En plus des espèces conventionnelles telles que les humains, les singes, les souris, les rats et d'autres mammifères, le séquençage unicellulaire est également largement utilisé chez les organismes d'eau douce, les animaux marins, les reptiles, les amphibiens, les espèces aviaires, les insectes, les plantes, etc. (par exemple, les poissons-zèbres, les méduses, les serpents, les grenouilles, les oiseaux, les mouches des fruits, les parasites, les hydres, l'Arabidopsis, les cultures, les plantes protégées). De nombreuses espèces doivent être échantillonnées, préservées et transportées en fonction des caractéristiques de l'espèce et de leur environnement. Les conditions de préservation et de transport doivent être adaptées aux caractéristiques de l'espèce et de son environnement.

Tri cellulaire

Tri par flux

Le tri par cytométrie en flux utilise la fluorescéine pour marquer différentes molécules et distingue les cellules cibles des cellules non cibles en ajustant la tension appropriée, la compensation, etc. Dans le domaine du séquençage de cellules uniques, le tri par flux peut distinguer des populations cellulaires spécifiques et permettre l'optimisation de la qualité des suspensions de cellules uniques, permettant ainsi des études plus ciblées et précises.

Une pré-expérimentation est recommandée avant le tri afin de comprendre le pourcentage de contenu des cellules cibles comme moyen d'optimiser les conditions de tri du cytomètre en flux.
2. Temps de tri : en fonction de la tolérance des cellules à trier, afin d'assurer la viabilité cellulaire, il est recommandé de terminer dans un délai d'une heure.
3. Solution de collecte de cellules : 1 x DPBS (ou milieu), 0,04 % BSA / 5 % FBS.
4. Pour les cellules triées par flux, le principe de non-nécessité non-congélation doit être suivi.

Tri des billes immunomagnétiques

Le tri cellulaire par billes immunomagnétiques est réalisé en attachant des anticorps spécifiques capables de se lier aux antigènes de surface cellulaire à des billes magnétiques. Selon la différence des cellules marquées, le tri par billes magnétiques est généralement divisé en deux catégories : le tri positif et le tri négatif.

1. Pour le tri par billes magnétiques, la distinction et la sélection des kits de tri positifs et négatifs sont particulièrement importantes, et il convient de prêter attention à la fiabilité des réactifs de tri et à l'efficacité du tri.
2. pré-expériences pour estimer la proportion de cellules cibles afin de faciliter la préparation formelle des échantillons.
3. Le tri de cellules rares peut être sélectionné en utilisant la méthode de tri composite, qui est principalement utilisée pour le tri de sous-populations cellulaires ou la séparation de cellules à haute pureté.
4. Après le tri, les cellules s'agglomèrent facilement, donc évitez l'enrichissement par centrifugation à grande vitesse.

Considérations de tri

1. Lysis des érythrocytes : s'il y a une précipitation rouge visible à l'œil nu dans l'échantillon original, les globules rouges doivent être lysés en premier, mais il faut faire attention au temps de lyse pour éviter d'endommager d'autres cellules.
2. Correction du comptage : la valeur de comptage des cellules obtenue par tri cellulaire peut être supérieure au nombre total réel de cellules (20-80 %), nécessitant l'utilisation de compteurs ou de microscopie pour la correction du comptage.
3. Collecte des cellules : il est recommandé que la vitesse de centrifugation soit inférieure à 500 g, car plus de 500 g peut facilement entraîner une resuspension ou un agglutination des cellules. Si vous êtes inquiet au sujet de la collecte des cellules, vous pouvez augmenter le temps de centrifugation.