Séquençage par purification d'affinité de l'ADN (DAP-seq) est une technologie de séquençage épigénomique qui a émergé dans le domaine de la recherche sur les plantes ces dernières années, capable de se concentrer sur une protéine (par exemple, diverses protéines de facteurs de transcription impliquées dans la transcription des gènes), d'étudier les séquences d'ADN auxquelles ces protéines sont liées, d'analyser les caractéristiques de liaison et d'identifier le schéma de liaison des protéines pour cibler les gènes régulés par ces protéines. Le plus grand avantage de la technologie DAP-seq est qu'elle utilise l'expression in vitro de protéines marquées pour lier le produit d'expression à la séquence du génome cible, ce qui évite parfaitement le dilemme du manque d'anticorps protéiques auquel le domaine de la recherche sur les plantes a été confronté pendant longtemps dans le passé.
Avantages de la technologie DAP-seq
Séquençage par purification d'affinité de l'ADN (DAP-seq) représente une avancée contemporaine dans l'exploration des sites régulateurs transcriptionnels, ayant gagné en importance ces dernières années. Cette approche innovante implique l'utilisation de constructions in vitro pour exprimer des protéines de facteurs de transcription (TF). Ces protéines se lient ensuite sélectivement à des fragments génomiques cibles, permettant le séquençage des fragments de gènes liés aux protéines pour la construction de bibliothèques et l'analyse des séquences de liaison des TF.
L'avènement de technologie DAP-seq aborde les limitations historiques associées à la rareté des anticorps des facteurs de transcription (TF) et à l'efficacité de liaison suboptimale. En surmontant ces contraintes, le DAP-seq élargit considérablement les horizons de la recherche sur les facteurs de transcription. Cette technologie transformative ne résout pas seulement les défis passés, mais facilite également une exploration plus vaste et nuancée de la dynamique des facteurs de transcription, marquant un bond en avant substantiel dans le domaine.
Aperçu du processus expérimental DAP-seq
(1) Évaluation de faisabilité : Initiez le processus en fournissant la séquence CDS du facteur de transcription pour évaluation.
(2) Préparation des échantillons : Assurez-vous d'avoir un approvisionnement suffisant en échantillons, en suivant les directives énoncées dans les Directives de Livraison des Échantillons. De plus, incluez des plasmides contenant les facteurs de transcription cibles, soutenus par les résultats de séquençage fournis.
(3) Duplication d'échantillons : Évitez de mettre en place des échantillons dupliqués pour le même facteur de transcription. Si la duplication est nécessaire, il est conseillé d'établir deux à trois échantillons dupliqués et de réaliser l'expérience de duplication simultanément.
(4) Préparation des informations analysées : Rassembler des informations génomiques matures, y compris le fichier fa génomique, le fichier gff et le fichier pep.fa, adaptés à l'espèce étudiée.
Remarques : Bien que théoriquement, tous les facteurs de transcription des plantes puissent subir DAP-seqLa faisabilité des échantillons non végétaux est également prise en compte. Cependant, étant donné que le DAP est principalement conçu pour les systèmes d'expression végétale, les résultats ultérieurs pour les échantillons non végétaux ne sont pas garantis. Il est important de noter que les protéines des facteurs de transcription ne peuvent pas faire l'objet d'une analyse de faisabilité, et la fiabilité des résultats ultérieurs n'est pas assurée.
Les étapes principales englobent Construction de bibliothèque d'ADN, expression des protéines, réactions de liaison entre la protéine et la bibliothèque, PCR de la bibliothèque avec épissage et détection quantitative, séquençage en ligne et analyse des données brutes.
(1) Extraction d'ADN génomique complet et construction de bibliothèque :
- Commencez par extraire l'ADN génomique complet du matériau tissulaire.
- Ensuite, construisez la bibliothèque d'ADN.
Construction de Plasmides d'Expression In Vitro pour les Facteurs de Transcription
- Développer le plasmide d'expression in vitro avec étiquette Halo pour les facteurs de transcription.
- Utilisez le système d'embryon de blé pour l'expression des protéines.
(3) Interaction et enrichissement de la bibliothèque de protéines
- Combinez la protéine et la bibliothèque.
- Utilisez des billes magnétiques pour enrichir les fragments d'ADN liés à la protéine cible.
(4) Lavage et purification complexe
- Effectuer plusieurs lavages pour éliminer la chromatine liée de manière non spécifique.
- Purifiez le complexe résultant.
(5) Purification des fragments d'ADN, séquençage et analyse des données brutes
- Purifier des fragments d'ADN.
- Effectuer une analyse de séquençage sur une plateforme en ligne.
- Analyser les données de séquençage brutes pour en tirer des informations significatives.
Analyse des données DAP-seq
- Contrôle de la qualité et filtrage des données
Le traitement initial implique le contrôle de qualité et le filtrage des données brutes, la résolution des problèmes communs et l'élimination des données de faible qualité.
Le contrôle qualité ultérieur garantit la fiabilité en examinant minutieusement les données nettoyées filtrées.
- Comparaison des séquences de génome de référence
En utilisant des données propres, effectuez une comparaison complète avec la séquence du génome de référence.
Identifiez les emplacements génomiques où les lectures séquencées sont mappées.
- Appel de pics et génération de fichiers Bam
Générez un fichier bam après la comparaison.
Utilisez un logiciel pour exécuter l'appel de pics sur le fichier bam, identifiant les accumulations de lectures significatives qui indiquent les emplacements de liaison des facteurs de transcription étudiés.
Réalisez une analyse détaillée des pics obtenus, en tenant compte de facteurs tels que le nombre de pics, la longueur, la distribution génomique et la répartition à travers les éléments fonctionnels des gènes.
- Annotation fonctionnelle et analyse d'enrichissement
Appliquer l'annotation GO et KEGG aux gènes associés aux pics, en dévoilant leurs fonctions.
Effectuez une analyse d'enrichissement pour obtenir des informations sur la signification fonctionnelle de ces gènes.
Prédire les facteurs de transcription des plantes et des animaux associés aux gènes, en fournissant des couches supplémentaires de compréhension.
Une étape cruciale implique l'analyse des motifs pour identifier les caractéristiques de liaison potentielles des facteurs de transcription.
Prédire des motifs pour améliorer la compréhension des caractéristiques de liaison des facteurs de transcription, facilitant ainsi la validation ultérieure.
Flux de travail en bioinformatique de DAP-Seq – CD Genomics
Analyse intégrée du transcriptome et DAP-seq dans la recherche sur les plantes
Dans le domaine des sciences végétales, il y a un intérêt croissant pour la combinaison de l'analyse du transcriptome et technologie DAP-seq dévoiler des processus biologiques complexes. Cette nouvelle approche consiste à utiliser le transcriptome pour identifier les différences génétiques intergroupes. En même temps, DAP-seq est employé pour examiner les gènes spécifiques ciblés par les facteurs de transcription, éclaircissant ainsi le réseau régulatoire complet.
Cette analyse intégrée offre une compréhension holistique, reliant les cibles de liaison des facteurs de transcription à l'émergence de gènes exprimés de manière différentielle et à leurs distinctions fonctionnelles qui en découlent. Les expériences biologiques ultérieures, telles que le knockdown ou la surexpression des gènes, servent d'outils de validation. En corrélant les données de ces deux perspectives génomiques, une amélioration synergique de la profondeur de la recherche sur le transcriptome est réalisée. Cette approche globale fournit des éclaircissements sur le réseau d'expression régulatoire des gènes, mettant en lumière leurs mécanismes régulateurs en amont.
Veuillez vous référer à notre article. Comment utiliser DAP-Seq pour des études de facteurs de transcription chez des organismes non-modèles ? pour un dossier.
La connexion entre ces deux méthodologies tourne autour des orientations des facteurs de transcription et de leurs gènes cibles respectifs.
- Identification des facteurs de transcription
Les facteurs de transcription fonctionnels se manifestent souvent dans données RNA-seq, montrant une expression différentielle entre les échantillons ou le statut des gènes centraux au sein du réseau de régulation génique.
Les facteurs de transcription répondant à ces critères deviennent des candidats pour une enquête plus approfondie et servent de cibles essentielles pour les étapes suivantes. DAP-seq construction d'expérience.
- Découverte de gènes cibles
Les informations extraites par DAP-seq révèlent les préférences de reconnaissance de séquence d'ADN des facteurs de transcription, exposant essentiellement des sites de liaison potentiels.
Prédire la relation réglementaire entre les facteurs de transcription et les gènes cibles est réalisable en tirant parti de ces sites de liaison potentiels.
La validation de l'impact réel des gènes cibles sur le phénotype se fait au niveau transcriptionnel et est réalisée par données RNA-seq.
La convergence des résultats de ces deux méthodologies identifie souvent le gène cible ultime contribuant au phénotype observé, offrant une compréhension approfondie de la régulation transcriptionnelle.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
Directives de Soumission d'Échantillons
