Séquençage génomique par bisulfite (BSP-Seq) - Identification de la méthylation pour l'ADNss et l'ADNds

L'un des principaux mécanismes de modification épigénétique est Méthylation de l'ADNIl a une influence substantielle sur l'expression des gènes, ce qui affecte directement l'activité cellulaire. C'est un événement épigénétique dans la modulation de l'empreinte génomique, du développement embryonnaire, de la différenciation cellulaire, de l'inactivation de l'X et de la prolifération cellulaire. Cependant, une méthylation anormale de l'ADN est couramment associée à l'instabilité de l'ADN et du génome, conduisant au développement de maladies telles que le cancer. Lorsque la méthylation de l'ADN se produit sur certains gènes liés au cancer, cela peut entraîner le silence des gènes suppresseurs de tumeurs et la tumorigénèse. Cela crée une demande cruciale pour des méthodes hautement sensibles et fiables afin d'explorer des stratégies diagnostiques et thérapeutiques innovantes. L'illumination des régions de méthylation de l'ADN facilite l'investigation du développement cellulaire, du silence transcriptionnel et de la découverte de biomarqueurs.

Séquençage génomique au bisulfite utilise le bisulfite de sodium pour la conversion de l'ADN, ce qui révolutionne l'analyse de la méthylation de l'ADN. Cependant, le traitement au bisulfite est un processus agressif qui convertit un ADN double brin stable en brins simples fragmentés, la plupart des cytosines étant converties en uracile. Ces conversions soulèvent des préoccupations et nécessitent des ajustements en spectrophotométrie UV, PCR et électrophorèse sur gel d'agarose.

Figure 1. Conversion au bisulfite et séquençage des échantillons (Li, 2011)

La méthylation sur une chaîne d'ADN peut être détectée lorsque les cytosines non méthylées dans l'ADN simple brin sont converties en résidus d'uracile, qui sont reconnus comme de la thymine lors de l'amplification PCR ultérieure. En revanche, les cytosines méthylées sont immunisées contre cette conversion et restent sous forme de cytosines, permettant ainsi de distinguer les Cs méthylés des Cs non méthylés. Déterminer le statut de méthylation dans les loci d'intérêt nécessite une réaction PCR ultérieure utilisant des amorces spécifiques de méthylation après le traitement au bisulfite de sodium. Le statut de méthylation peut être connu soit par séquençage direct du produit PCR, soit par séquençage de sous-clonage. Cependant, le séquençage direct du produit PCR donne généralement une qualité médiocre et peut fausser la quantification ; par conséquent, le clonage suivi du séquençage est recommandé. De plus, la pyroséquençage peut être utilisée comme alternative au séquençage direct PCR.

L'analyse de séquençage au bisulfite peut non seulement identifier la méthylation le long de l'ADN simple brin, mais aussi détecter les motifs de méthylation sur les brins d'ADN double, puisque les produits d'amplification peuvent être mesurés individuellement et que les brins d'ADN convertis ne sont plus auto-complementaires. La Figure 1 montre les points forts du processus de conversion de l'ADN. Un spectrophotomètre UV est utilisé pour la quantification de l'ADN converti en tant qu'ARN. Pour l'évaluation de la qualité, l'ADN converti sera soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 2%. Les bandes apparaîtront sous forme de traînées allant de 1500 à 100 pb. Les amorces PCR au bisulfite sont plus longues tandis que les amplicons sont plus courts que la normale. Le séquençage au bisulfite de génome entier (WGBS) et le séquençage au bisulfite à représentation réduite (RRBS) sont les deux approches qui peuvent être utilisées pour évaluer la méthylation de l'ADN en utilisant le NGS.

Référence :

1. Li, Y., Tollefsbol, T. O. Détection de la méthylation de l'ADN : analyse de séquençage génomique par bisulfite. Méthodes en biologie moléculaire, 2011, 791, 11–21.