NGS-BSP

CD Genomics se spécialise dans les services NGS-BSP, offrant des capacités avancées pour une approche complète. Analyse de la méthylation de l'ADNNotre service utilise une technologie de pointe. technologie NGS pour cartographier et quantifier avec précision les cytosines méthylées, fournissant des informations détaillées sur les modifications épigénétiques à travers divers échantillons biologiques. Cela permet une caractérisation précise des mécanismes de régulation des gènes et facilite la recherche sur les maladies complexes.

L'introduction du NGS-BSP

La méthylation de l'ADN affecte fortement la structure de la chromatine et la régulation de l'expression génique. Pendant de nombreuses années, le séquençage au bisulfite par PCR (BSP) a été considéré comme la "référence" pour mesurer la méthylation de l'ADN dans des régions spécifiques. Le BSP présente une grande fiabilité et précision, et peut déterminer avec exactitude le statut de méthylation de chaque site CpG dans le fragment. Séquençage de nouvelle générationLa PCR de séquençage bisulfite basé sur NGS (NGS-BSP) peut fournir des informations plus précises sur les modifications de méthylation et est applicable à certains gènes dont les régions de détection méthylées sont connues, tout en étant également adaptée à l'exploration des régions de méthylation significatives des gènes.

Principe expérimental du BSP :

L'ADN génomique est traité avec du bisulfite, convertissant tous les cytosines non méthylés en uracile tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. Par la suite, des amorces sont conçues aux deux extrémités des îlots CpG pour l'amplification par PCR. Les produits cibles purifiés sont ensuite clonés en utilisant le clonage TA. Chaque clone est ensuite sélectionné pour le séquençage afin d'identifier les clones positifs. Enfin, les séquences obtenues sont comparées à la séquence originale pour déterminer les sites de méthylation et quantifier le degré de méthylation.

Figure 1. Principe expérimental de la BSP.

Avantages de notre service NGS-BSP

• Détecter rapidement tous les sites de méthylation
• Haute capacité, Haute précision, Résultats simples et intuitifs
• Plus économique et gain de temps par rapport au BSP original si vous testez de nombreux échantillons.

Applications du NGS-BSP

• Recherche en épigénétique
• Applications cliniques
• Études environnementales et exposome
• Recherche Agricole et Animale

Flux de travail NGS-BSP

En bref, des amorces BSP ont été conçues à l'aide du logiciel en ligne MethPrimer. L'ADN génomique (1 µg) a été converti à l'aide du ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO) et un vingtième des produits d'élution a été utilisé comme modèle pour l'amplification PCR. Pour chaque échantillon, des produits BSP de plusieurs gènes ont été générés, regroupés de manière égale et soumis à une ligation d'adaptateurs. Des bibliothèques barcodées provenant de tous les échantillons ont été séquencées sur la plateforme Illumina Hiseq en utilisant la stratégie paired-end de 150 pb.

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon quantité d'ADNg : ≥ 1 μg ; Concentration d'ADN ≥ 30 ng/μl, OD260/280=1,8~2,0 Tout l'ADN doit être traité avec de l'ARNase et ne doit montrer aucune dégradation ni contamination. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Illumina HiSeq, PE150. Profondeur de couverture ≥ 100x.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Traitement des données brutes Alignement des données de séquençage Évaluation du taux de conversion au bisulfite dans les données de séquençage Analyse de la profondeur de séquençage et de la couverture dans les régions cibles Calcul des niveaux de méthylation de la cytosine (C) Visualisation des niveaux de méthylation dans les régions cibles Analyse statistique de la distribution du niveau de méthylation dans les régions cibles Analyse de cluster des niveaux de méthylation dans les régions cibles parmi plusieurs échantillons Analyse personnalisée Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans NGS-BSP pour votre écriture (personnalisation)

CD Genomics vous propose une consultation à chaque étape du processus pour vous assurer que vous tirez le meilleur parti de vos données. Nous offrons une assistance professionnelle, de la planification des expériences au séquençage et à l'analyse des données. Si vous avez des besoins spécifiques, faites-le nous savoir et nous serons là pour vous aider. Nous serions ravis d'avoir l'opportunité de travailler avec vous. Veuillez nous contacter pour plus d'informations et un devis détaillé.

Références

1. Pan X, Gong D, Nguyen DN, et al.La colonisation microbienne précoce affecte la méthylation de l'ADN des gènes liés à l'immunité intestinale et au métabolisme chez les porcs prématurés. Recherche sur l'ADN, 2018.
2. Zhang S, Shen L, Xia Y, et al.Paysage de la méthylation de l'ADN des dépôts de graisse et composition en acides gras chez les porcs obèses et maigres. Rapports Scientifiques, 2016, 6:35063.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Comment le processus de traitement au bisulfite est-il réalisé ?

Le traitement au bisulfite implique l'exposition de l'ADN au bisulfite de sodium, entraînant la désamination des résidus de cytosine non méthylés en uracile, tout en laissant les cytosines méthylées inchangées. Cette modification chimique permet de différencier les cytosines méthylées et non méthylées lors du séquençage, facilitant ainsi l'analyse ultérieure des motifs de méthylation de l'ADN.

2. Quels sont les outils couramment utilisés pour l'analyse des données NGS-BSP ?

Divers outils et logiciels spécialisés sont utilisés pour l'analyse des données NGS-BSP, notamment :

• FastQC : pour évaluer la qualité des données de séquençage brutes.
• Trim Galore : pour supprimer les lectures de faible qualité et les séquences d'adaptateurs.
• Bismark : pour aligner les lectures traitées au bisulfite sur le génome de référence et déterminer les niveaux de méthylation de l'ADN.
• SAMtools : pour gérer les fichiers d'alignement.
• MethylKit : pour réaliser des analyses de méthylation différentielle et visualiser les résultats.
• IGV (Integrative Genomics Viewer) : pour visualiser les motifs de méthylation.
• HOMER : pour annoter les éléments génomiques fonctionnels.
• Analyse KEGG et GO : pour élucider les voies biologiques influencées par les changements de méthylation de l'ADN.

3. Quelles sont les considérations clés pour l'extraction d'ADN dans le NGS-BSP ?

Pour la mise en œuvre réussie de NGS-BSP, l'extraction d'ADN de haute qualité est un pilier fondamental. Il est impératif de prendre en compte les considérations suivantes :

Utilisation de techniques d'extraction d'ADN qui fournissent un ADN d'une pureté et d'une intégrité élevées. Prévention de la contamination par l'ARN, les protéines ou d'autres impuretés étrangères. Garantie que l'ADN est présent en quantité et en concentration adéquates pour les applications ultérieures.

4. Comment l'efficacité de la conversion au bisulfite est-elle évaluée ?

L'efficacité de la conversion par bisulfite peut être évaluée par divers moyens :

• Incorporation d'ADN de contrôle non méthylé et garantie d'une conversion complète (absence de cytosines résiduelles).
• Séquençage de l'ADN converti par bisulfite et détermination du taux de conversion (pourcentage de cytosines non méthylées converties en uracile).
• Utilisation de contrôles de spike-in ou de standards internes pour surveiller l'efficacité de la conversion.

5. Comment concevez-vous des amorces pour le NGS-BSP ?

Conception de primers pour NGS-BSP nécessite une attention particulière en raison des modifications de séquence induites par le traitement au bisulfite :

• Conception de primers dépourvus de cytosines pour permettre leur conversion en uraciles (qui se transforment en thymines après la PCR).
• Exploitation d'outils logiciels tels que MethPrimer ou BiSearch pour la création de primers spécifiques au bisulfite.
• Vérification de l'efficacité et de la spécificité des amorces par validation avec de l'ADN traité au bisulfite.

Changements de méthylation des promoteurs dans le placenta impliqués dans la relation entre la dépression prénatale et le petit pour l'âge gestationnel.

Journal : BMC Grossesse et Accouchement

Facteur d'impact : 3,105

Publié : 02 octobre 2022

Contexte

La dépression et l'anxiété pendant la grossesse affectent 10 % à 40 % des femmes enceintes et sont liées à un faible poids à la naissance et à un retard de croissance intra-utérin. Des niveaux accrus de glucocorticoïdes en raison d'une dysfonction de l'axe HPA peuvent avoir un impact sur le développement fœtal via le placenta, qui régule l'exposition aux glucocorticoïdes par l'intermédiaire de HSD11β2. Les hormones thyroïdiennes (axe HPT) et la mélatonine (axe HPA) jouent également un rôle. Les émotions maternelles peuvent provoquer des changements épigénétiques au niveau du placenta. Cette étude utilisera séquençage de nouvelle génération et Analyse de la méthylation de l'ADN techniques pour examiner la relation entre SGA et les émotions maternelles, en investiguant spécifiquement les changements de méthylation dans des gènes tels que CRH, HSD11β2, SLC16A10, DIO3 et MTNR1B.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Une étude cas-témoins imbriquée a révélé que la dépression maternelle au deuxième trimestre est un facteur de risque pour le petit poids de naissance (SGA). Les placentas ont été divisés en quatre groupes en fonction de l'état de dépression et de SGA, avec 17 échantillons chacun. Les niveaux de méthylation des gènes CRH et DIO3 étaient plus élevés chez les mères déprimées, tandis que les niveaux de HSD11β2 étaient plus élevés chez les mères non déprimées. La méthylation de CRH et de HSD11β2 était corrélée à la dépression, et la méthylation de DIO3 était corrélée au SGA, suggérant que la dépression maternelle pourrait influencer le développement fœtal à travers ces changements épigénétiques.

Figure 1. Méthylation des gènes CRH, HSD11β2, SLC16A10, DIO3 et MTNR1B dans le placenta.

Figure 2. Comparaison des niveaux de méthylation des gènes placentaires (CRH, HSD11β2, DIO3, SLC16A10 et MTNR1B) dans quatre groupes.

Figure 3. Comparaison du niveau de méthylation de CRH, HSD11β2, DIO3, SLC16A10, MTNR1B en fonction de la dépression de la mère et de la naissance SGA.

Conclusion

La dépression maternelle au cours du deuxième trimestre perturbe les axes HPA et HPT, augmentant le risque de petit poids de naissance (SGA) par des changements de méthylation génique placentaire (DIO3, HSD11β2, CRH). Le dépistage précoce et l'intervention sont cruciaux en raison des effets potentiels à long terme sur le comportement et le développement des enfants. Les professionnels de la santé devraient donner la priorité au soutien émotionnel des femmes enceintes et surveiller les enfants de mères dépressives pour évaluer les impacts sur le développement. L'augmentation des tailles d'échantillons dans les recherches futures améliorera la validité de ces résultats.

Référence

1. Yang J, Xu A, Zhang Y, et al. Changements de méthylation des promoteurs dans le placenta impliqués dans la relation entre la dépression prénatale et le petit poids pour l'âge gestationnel. BMC Grossesse et Accouchement2022, 22(1):741.