Séquençage du transcriptome dans le protocole d'infection virale

Infection des cellules

1. Ensemencez des cellules CRFK dans des flacons de 75 cm² et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu'à ce que les cellules atteignent 60–70 % de confluence.
2. Retirez le milieu et lavez les cellules avec du D-PBS.
3. Infectez les flacons avec le virus à un multiplicité d'infection (MOI) de 2 dans 2 ml, ou 2 ml de D-PBS comme contrôle fictif, et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 1 h pour permettre l'attachement. Effectuez les inoculations en double, une pour l'extraction d'ARN et l'autre pour la visualisation des CPE.
4. Ajoutez 10 ml de milieu de maintenance avec 10 % de FBS et incubez les flacons pendant 3 h.
5. Après 3 h d'incubation, retirez l'inoculum, lavez les cellules avec du D-PBS.
6. Ajoutez 2 ml de TrypLE et incubez pendant 1 à 2 min jusqu'à ce que les cellules se détachent.
7. Transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse et précipitez les cellules par centrifugation à 120 × g pendant 5 min et jetez le surnageant.
8. Ajoutez 10 ml de D-PBS et répétez la centrifugation afin d'éliminer toute trace de milieu et de TrypLE, qui pourrait réduire le rendement en ARN.
9. Jetez les surnageants et conservez les culots cellulaires à −80 °C jusqu'à la purification de l'ARN.

Purification de l'ARN à partir de cellules infectées

Le kit RNeasy a été utilisé pour extraire et purifier les échantillons d'ARN dans cette étude, mais d'autres protocoles d'extraction d'ARN peuvent également être adaptés.
1. Vaporisez toutes les micropipettes, gants, zone de travail et autres objets avec RNase AWAY pour éliminer toute contamination par des RNases et de l'ADN.
2. Extrayez l'ARN en utilisant le kit RNeasy selon les instructions du fabricant.
3. Aliquotez les ARN éludés (500 μl) dans trois tubes différents pour éviter le dégel et le congélation répétés de l'échantillon, ce qui pourrait affecter la qualité de l'ARN.
4. Utilisez deux tubes pour l'analyse de contrôle qualité avec un spectrophotomètre et un bio-analyseur Illumina Agilent 2100 et conservez le troisième à −80 °C pour le séquençage.

Analyse de la qualité de l'ARN total

1. Déterminez la qualité de l'ARN extrait en mesurant l'absorbance à 260 et 280 nm dans un spectrophotomètre UV/Visible.
2. Considérez les échantillons avec un rapport d'absorbance (A260/A280) de 1,8 à 2,0 pour une analyse ultérieure avec le bio-analyseur Illumina Agilent 2100 afin de déterminer à la fois la qualité et la quantité de l'ARN.
3. Afin de garantir que les échantillons sont de la plus haute qualité et quantité pour le séquençage du transcriptome, effectuez une analyse de qualité et de quantité sur les échantillons d'ARN total extraits.
4. Chargez et préparez les mélanges gel-colorant, puis chargez le marqueur, l'échelle et les échantillons de la manière spécifiée.
5. Vortexez la puce et insérez-la. Analysez les puces selon la méthode recommandée par le fabricant. Vérifiez si l'exécution est réussie et si l'échantillon est correctement préparé et manipulé en s'assurant qu'il a été correctement pipeté dans les puits.

Préparation des échantillons pour le séquençage à paires

Effectuez les étapes suivantes en utilisant les réactifs fournis dans le kit de préparation d'échantillons à paires, selon les instructions du fabricant.
1. Fragmenter l'ADN génomique en fragments de moins de 800 pb.
2. Effectuez la réparation des extrémités des fragments d'ADN pour générer des extrémités plates phosphorylées à 5'.
3. Ajoutez une base "A" aux extrémités 3' pour créer un surplomb 3'-dA.
4. Liez des adaptateurs aux extrémités des fragments d'ADN.
5. Purifiez les produits de ligation en éliminant les adaptateurs non ligaturés.
6. Enrichissez les fragments d'ADN modifiés par adaptateur par PCR.
7. Obtenez la bibliothèque d'ADN génomique.