Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage Sanger
Questions générales
- Pourquoi le résultat du séquençage de Sanger indique-t-il que le modèle est promiscue alors que l'essai d'électrophorèse est bon ?
- Les résultats de l'électrophorèse des produits de PCR ne sont qu'un résultat qualitatif approximatif. Les produits d'amplification PCR non spécifiques qui diffèrent en taille de seulement quelques bases du fragment cible ne peuvent pas être distingués à l'œil nu. Cependant, Séquençage de l'ADN de Sanger Les réactions sont sensibles et objectives, et peuvent refléter directement le modèle lui-même. Si vous n'êtes pas sûr de la pureté du produit PCR, nous espérons que vous pourrez cloner le produit PCR pour garantir de bons résultats de séquençage.
- Les amorces PCR peuvent-elles être utilisées comme amorces de séquençage Sanger ?
- Les amorces PCR peuvent être utilisées comme amorces de séquençage Sanger, mais plus l'amorce PCR est longue, moins le résultat du séquençage peut être satisfaisant. Par conséquent, toutes les amorces PCR ne sont pas adaptées à une utilisation en tant qu'amorces de séquençage.
- Qu'est-ce qu'une délétion de base dans le séquençage de Sanger ?
- Les suppressions de bases sont couramment trouvées dans les produits de PCR, en particulier dans les fragments de PCR amplifiés à partir du génome.
- Comment utiliser le séquençage de Sanger pour résoudre les suppressions de bases ?
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(1) Continue le séquençage en utilisant des amorces inverses pour corriger le site de délétion et obtenir un passage. Alternativement, clonez le produit PCR dans un plasmide et sélectionnez un clone unique pour le séquençage.
(2) S'il peut être déterminé qu'il ne devrait pas y avoir de site manquant dans ce fragment PCR, alors les conditions de réaction PCR peuvent être modifiées et réamplifiées.
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(1) Continue le séquençage en utilisant des amorces inverses pour corriger le site de délétion et obtenir un passage. Alternativement, clonez le produit PCR dans un plasmide et sélectionnez un clone unique pour le séquençage.
- Quels sont les effets des structures dupliquées sur le séquençage de Sanger ?
- Les structures dupliquées entraîneront un glissement du cadre de réplicat de séquençage et une confusion du motif de pic après la structure dupliquée.
- Comment utiliser le séquençage de Sanger pour résoudre des structures dupliquées ?
- Le séquençage du modèle avec des amorces inverses sur la structure dupliquée complétera l'épissage de la longueur complète du modèle.
- Quel est le résultat du séquençage Sanger de la structure Poly ?
- Prenons l'exemple de polyT, après la structure polyA/T, il y a souvent des décalages, des doubles pics et des ensembles de pics, tandis qu'après polyG/C, cela conduit souvent à une atténuation du signal de séquençage ou à une interruption directe.
- Quel aspect a un graphique de pic de séquençage avec un résultat bimodal à l'avant dans le séquençage Sanger ?
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(1) Le produit contient un petit fragment de produit PCR.
(2) Le amorce a deux sites de liaison et l'un des résultats est interrompu.
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(1) Le produit contient un petit fragment de produit PCR.
- Comment résoudre le résultat bimodal frontal dans le séquençage Sanger ?
- Séquençage inversé avec un primer différent.
- Que dois-je faire s'il n'y a pas de signal dans le séquençage Sanger ?
- Dans le cas où la confirmation des amorces, la concentration d'extraction du plasmide, l'agencement des réactions et d'autres conditions sont corrects, si le résultat du séquençage présente un motif de pics désordonné et une valeur de signal inférieure à 100, alors le résultat sera jugé comme n'ayant pas de signal pour le séquençage.
- Pourquoi ne puis-je pas trouver les amorces dans les résultats de séquençage Sanger ?
- Les résultats de séquençage commencent généralement à atteindre un pic 30-50 pb après les amorces, donc les amorces ne sont pas présentes dans les résultats originaux.
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Quelles sont les causes des signaux de séquençage faibles dans le séquençage de Sanger ?
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(1) quantité excessive de modèle dans la réaction de PCR de séquençage
(2) dégradation des produits de PCR
(3) Contaminants dans l'échantillon qui inhibent l'activité de l'ADN polymérase
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(1) quantité excessive de modèle dans la réaction de PCR de séquençage
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Que se passe-t-il si le signal de séquençage est faible ?
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(1) réduire la quantité de modèle dans la réaction de PCR de séquençage
(2) stockage des produits de PCR à 4 °C pendant pas plus de 48 heures, un stockage à long terme à -20 °C est requis.
(3) Repurifiez l'échantillon
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(1) réduire la quantité de modèle dans la réaction de PCR de séquençage
- Quelles sont les causes d'un signal de séquençage fort dans le séquençage de Sanger ?
- La quantité de modèle dans la réaction de séquençage est trop élevée, ce qui entraîne un signal fort.
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Que dois-je faire si le signal de séquençage est trop fort ?
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(1) re-capillarisation par électrophorèse capillaire par dilution du produit téléchargé avec HIDI
(2) définir un temps d'injection plus court
(3) réorganiser la PCR et réduire la quantité de modèle dans la réaction de séquençage
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(1) re-capillarisation par électrophorèse capillaire par dilution du produit téléchargé avec HIDI
- Quelle est la raison du retard dans l'émergence des pics de séquençage dans le séquençage Sanger ?
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micro-bouchon capillaire
(2) présence d'impuretés dans le processus d'électrophorèse capillaire
(3) Si vous utilisez le kit de purification BigDye XTerminator, les microbilles de la solution XTerminator entrent en électrophorèse capillaire avec le produit, ce qui entraîne un alimentement anormal.
(4) Gel POP, tampon cathodique dépassant la durée d'utilisation
(5) La quantité d'échantillon entrant dans l'électrophorèse capillaire est trop importante.
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micro-bouchon capillaire
- Que devrais-je faire s'il y a un retard dans le séquençage des pics ?
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(1) rincer le tube capillaire avec le remplissage du réseau et re-capillariser l'électrophorèse.
(2) rincer la pompe de gel et le tube avec la solution de lavage, puis relancer l'électrophorèse capillaire.
(3) re-électrophorèse capillaire après agitation BDX et centrifugation suffisante pour permettre aux microbilles de précipiter
(4) remplacer le nouveau gel POP, tampon cathodique
(5) Re-capillariser l'électrophorèse après avoir dilué le produit supérieur avec HIDI ou réduit le temps d'injection.
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(1) rincer le tube capillaire avec le remplissage du réseau et re-capillariser l'électrophorèse.
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Quelles sont les causes des signaux de séquençage interrompus dans le séquençage de Sanger ?
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(1) chute de signal avant la fin de la séquence A-pic de fin : contient une séquence amplifiée non spécifique avec un signal fort et un signal faible de la séquence cible ;
(2) dégradation sévère du produit ;
L'efficacité de l'extension de l'ADN polymérase est réduite en raison de la rencontre de régions complexes.
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(1) chute de signal avant la fin de la séquence A-pic de fin : contient une séquence amplifiée non spécifique avec un signal fort et un signal faible de la séquence cible ;
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Que dois-je faire si mon signal de séquençage est interrompu ?
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(1) réextraire les acides nucléiques avec une taille d'échantillon augmentée et réévaluer
(2) PCR de resequencement et purification
(3) redessiner de nouveaux amorces ou séquençage inverse
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(1) réextraire les acides nucléiques avec une taille d'échantillon augmentée et réévaluer
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
