Protocole de préparation d'échantillons RIP-Seq

Obtenir le lysat cellulaire

1. Lavez les cellules dans la boîte de culture ou le flacon de culture deux fois avec du PBS froid.
2. Ajouter du PBS froid et racler les cellules avec un racloir à cellules, puis les collecter dans des tubes Eppendorf.
3. Centrifugez à 1500 tr/min pendant 5 minutes à 4°C, éliminez le surnageant et recueillez les cellules.
4. Resuspendre les cellules avec le même volume de lysat RIP que les cellules, bien agiter et laisser sur glace pendant 5 minutes.
5. Dispensez 200 μl de lysat cellulaire dans chaque tube et conservez à -80°C.

Préparation de billes magnétiques et d'anticorps

1. Resuspension des billes magnétiques.
2. Étiquetez les tubes Eppendorf nécessaires pour l'expérience.
Pipettez 50 μl des billes resuspendues dans chaque tube Eppendorf.
Ajoutez 500 μl de tampon de lavage RIP à chaque tube et agitez par vortex.
5. Placez les tubes Eppendorf sur un support magnétique, retirez le surnageant, répétez une fois.
6. Resuspendre les billes avec 100 μl de tampon de lavage RIP.
7. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
8. Placez le tube Eppendorf sur un support magnétique et jetez le surnageant.
Ajoutez 500 μl de tampon de lavage RIP, vortexez et agitez, puis jetez le surnageant, répétez une fois.
Ajoutez 500 μl de tampon de lavage RIP, vortexez et agitez, puis placez sur de la glace.

Immunoprécipitation des protéines liant l'ARN

1. Préparez le tampon d'immunoprécipitation RIP.
2. Placez les tubes Eppendorf de l'étape précédente sur un support magnétique, retirez le surnageant et ajoutez 900 µl de tampon d'immunoprécipitation RIP à chaque tube.
3. Décongelez rapidement le lysat cellulaire préparé à l'étape précédente et centrifugez. Aspirez 100 μl de surnageant dans le complexe d'anticorps sur billes magnétiques de l'étape précédente pour obtenir un volume total de 1 ml.
4. Incuber pendant 3 h à 4°C jusqu'à overnight.
5. Centrifugez brièvement, placez le tube Eppendorf sur un support magnétique et jetez le surnageant.
6. Ajoutez 500 μl de tampon de lavage RIP, vortexez et secouez le tube Eppendorf sur le support magnétique, éliminez le surnageant, répétez le lavage 6 fois.

Purification de l'ARN

1. Préparez le tampon de protéinase K. 150 µl pour chaque échantillon.
2. Resuspendre le complexe de billes magnétiques-antibody ci-dessus avec 150 µl de tampon de protéinase K.
3. Incuber à 55°C pendant 30 minutes.
4. Après incubation, placez le tube enpendoff sur un support magnétique et transférez le surnageant dans un nouveau tube enpendoff.
Ajoutez 250 μl de tampon de lavage RIP à chaque tube de surnageant.
Ajoutez 400 μl de phénol:chloroforme:alcool isoamylique à chaque tube, vortexez et agitez, puis centrifugez à 14 000 rpm pendant 10 minutes à température ambiante.
7. Aspirez soigneusement 350 μl de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube enpendoff.
Ajoutez 400 μl de chloroforme à chaque tube, vortexez pendant 15 s, puis centrifugez à 14 000 tr/min pendant 10 min à température ambiante.
9. Aspirez soigneusement 300 μl de la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube enpendoff.
Ajoutez 50 μl de Solution I, 15 μl de Solution II, 5 μl de l'Améliorateur de Précipité, 850 μl d'éthanol anhydre (sans RNase) dans chaque tube, mélangez et conservez à -80°C pendant 1h jusqu'à toute la nuit.
11. Centrifuger à 14 000 tr/min, 4 °C pendant 30 min, retirer soigneusement le surnageant.
12. Rincer une fois avec de l'éthanol à 80 %, centrifuger à 14 000 rpm pendant 15 min à 4 °C, retirer soigneusement le surnageant et laisser sécher à l'air.
Dissoudre 10-20 μl de DEPC dans de l'eau et conserver à -80℃.