ITS et séquençage d'amplicons fongiques : enquête sur les communautés fongiques dans le sol, les racines des plantes et les échantillons cliniques

Un écologiste de terrain échantillonnant des racines mycorhiziennes dans une forêt tempérée, un pathologiste des plantes suivant Fusarium flétrir à travers les champs de tomates, et un microbiologiste clinique profilant le mycobiome respiratoire d'individus immunodéprimés dans une cohorte de recherche partagent une question méthodologique commune : quelle région de l'ADN ribosomal fongique devrais-je séquencer, et quels amorces captureront la communauté qui m'intéresse réellement ? La réponse n'est rarement simple — elle dépend de savoir si vos champignons se trouvent à l'intérieur des racines des plantes, en libre circulation dans le sol, ou colonisant les muqueuses humaines.

Cet article est un guide pratique sur le séquençage des amplicons de l'espace transcrit interne (ITS) pour l'analyse des communautés fongiques. Nous passons en revue les décisions qui déterminent si un projet ITS aboutit à une taxonomie au niveau des espèces résoluble, quelles stratégies d'extraction et de primers fonctionnent pour chaque matrice d'échantillon, et comment éviter les pièges les plus courants qui transforment les données des communautés fongiques en listes ininterprétables d'OTUs non classifiés. Pour les chercheurs externalisant l'analyse des communautés fongiques, Séquençage des amplicons 16S/18S/ITS CD Genomics couvre l'ensemble du flux de travail ITS, de la qualité des échantillons à la classification taxonomique.

Pourquoi étudier les champignons avec l'ITS ?

Le royaume fongique est estimé à contenir entre 2,2 et 3,8 millions d'espèces, dont moins de 10 % ont été formellement décrites. Ils sont centraux dans le cycle du carbone terrestre, l'acquisition de nutriments par les plantes et — de plus en plus reconnu — la santé et les maladies humaines. Cependant, l'identification des champignons par morphologie ou culture est lente, biaisée en faveur des taxons sporulants et aveugle aux espèces non cultivables. L'identification basée sur l'ADN résout ce problème, et l'espaceur transcrit interne (ITS) de l'opéron de l'ARN ribosomal est le code-barres de consensus.

La région ITS se situe entre les gènes d'ARNr 18S (petite sous-unité) et 28S (grande sous-unité). Elle est transcrite mais éliminée lors de la maturation de l'ARNr, ce qui signifie qu'elle accumule des mutations à un rythme plus rapide que les régions codantes flanquantes — suffisamment rapide pour discriminer les espèces, mais suffisamment conservée au sein des espèces pour servir de code-barres fiable. La région ITS est divisée en ITS1 (entre 18S et 5,8S) et ITS2 (entre 5,8S et 28S), séparées par le gène très conservé 5,8S.

Quelle sous-région performe mieux ? La réponse dépend du groupe fongique. L'ITS1 offre une résolution plus élevée pour les Basidiomycètes — le phylum qui comprend les rouilles, les charbonnages et la plupart des champignons formant des champignons. L'ITS2 surpasse l'ITS1 pour les Ascomycètes, le plus grand phylum fongique englobant la plupart des moisissures, des agents pathogènes des plantes et des levures cliniquement pertinentes. Pour les études ciblant les deux phylums de manière égale, la région complète de l'ITS (ITS1 + 5.8S + ITS2, environ 450-700 pb selon les espèces) offre la couverture taxonomique la plus élevée. La paire d'amorces largement utilisée ITS1F/ITS4 amplifie la région complète de l'ITS et reste le choix le plus courant pour le profilage général des communautés fongiques.

La base de données UNITE est la référence centrale pour la taxonomie des ITS fongiques. Contrairement à SILVA ou Greengenes2, qui couvrent les trois domaines de la vie, UNITE est spécifiquement curée pour les champignons et utilise un système de regroupement d'hypothèses de espèces (SH) dynamique avec des seuils d'identité de 97 à 99 %. Pour la plupart des projets ITS fongiques, la classification contre UNITE v9.0+ avec un seuil de regroupement de 97 % fournit des attributions au niveau des espèces pour les groupes bien échantillonnés et des attributions au niveau des genres pour les lignées environnementales peu caractérisées.

Il est crucial de savoir ce que l'ITS ne peut pas faire. L'ITS ne distingue pas de manière fiable les souches au sein d'une espèce, ne capture pas le contenu fonctionnel des gènes et ne fonctionne pas pour les eucaryotes non fongiques. Si votre question nécessite un suivi au niveau des souches — traçant un Fusarium oxysporum forma specialis à travers les domaines, ou le suivi d'un Candida auris épidémie dans un hôpital — L'ITS seul est insuffisant. Il vous indique quelles espèces sont présentes et leurs abondances relatives, mais pas quels métabolites elles produisent ni si elles portent des gènes de résistance aux antifongiques.

Figure 1 : Structure de la région ITS dans l'opéron rDNA fongique — Couverture de l'ITS1 vs l'ITS2 et résolution taxonomique

Flux de travail de séquençage ITS

Extraction d'ADN : Le problème de la paroi cellulaire fongique

Les parois cellulaires fongiques sont plus résistantes que les parois cellulaires bactériennes — les polymères de chitine et de glucane résistent aux protocoles de lyse enzymatique qui fonctionnent bien pour les bactéries Gram-négatives. Les spores sont encore plus récalcitrantes. Le battage de perles avec des perles de zirconium/silice de 0,5 mm dans un homogénéisateur à haute vitesse (FastPrep ou Precellys) est le minimum pour récupérer l'ADN fongique à partir de spores et d'hyphes mélanisés. Dans une comparaison directe des méthodes d'extraction pour les communautés fongiques du sol, les protocoles utilisant la lyse mécanique (battage de perles) ont récupéré 40 à 60 % de plus d'OTUs fongiques que les protocoles uniquement enzymatiques, et la différence était la plus marquée pour les Ascomycètes — le phylum qui comprend la plupart des agents pathogènes des plantes.

Pour les échantillons de racines de plantes, le défi de la co-extraction fonctionne dans les deux sens. L'ADN végétal peut dominer l'extrait (le tissu racinaire est >95 % de plante en masse), diluant le signal fongique dans le séquençage en aval. La stérilisation de surface avec une solution d'hypochlorite de sodium à 2 % suivie de rinçages à l'eau stérile élimine les spores fongiques attachées à la surface mais préserve les champignons endophytes et mycorhiziens à l'intérieur de la racine. Pour le sol de rhizosphère, l'approche standard consiste à secouer vigoureusement les racines dans du PBS stérile, à collecter la boue de sol et à extraire à partir du culot — cela enrichit la communauté fongique adhérant à la racine sans submerger l'échantillon avec de l'ADN végétal.

Pour les échantillons cliniques — liquide de lavage broncho-alvéolaire, écouvillons cutanés, écouvillons vaginaux — l'ADN humain est le contaminant dominant. Contrairement au 16S où l'ADN hôte est absent (les mammifères n'ont pas de gènes 16S), les amorces ITS n'amplifient pas l'ADN humain car les humains manquent de l'opéron rDNA fongique. Cela signifie qu'aucune étape de déplétion de l'hôte n'est nécessaire pour la PCR ITS fongique à partir d'échantillons cliniques humains — un avantage pratique distinct par rapport au 16S bactérien où l'ADN hôte peut rivaliser avec le modèle microbien dans des échantillons à faible biomasse.

Amorces PCR : Le biais que vous ne pouvez pas éviter

Chaque paire de primers ITS présente des zones d'ombre taxonomiques. Le primer largement utilisé ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) associé à ITS2 (GCTGCGTTCTTCATCGATGC) amplifie uniquement l'ITS1. Cette paire capture la plupart des Ascomycètes et des Basidiomycètes, mais sous-amplifie les lignées fongiques à divergence précoce (Chytridiomycètes, Mucoromycètes), qui incluent les champignons mycorhiziens arbusculaires des Glomeromycètes — sans doute le groupe fongique le plus écologiquement significatif pour la biologie végétale.

Pour les études centrées sur les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA), la paire de primers dédiée AML1/AML2 ciblant la région 18S ou des primers ITS spécifiques aux CMA (par exemple, NS31/AML2) sont supérieurs aux primers ITS fongiques généraux. Les primers spécifiques aux CMA capturent les Glomeromycota que les primers ITS généraux manquent complètement. Le compromis : les primers spécifiques aux CMA sont aveugles aux champignons non-CMA, donc vous avez besoin d'une stratégie à deux amplicons (ITS général + spécifique aux CMA) pour un profilage complet de la communauté fongique des racines.

Pour la région ITS2 spécifiquement, la paire d'amorces ITS3/ITS4 (ou les amorces modifiées ITS3N/ITS4N) cible une région d'environ 250-350 pb et présente l'avantage d'une variation de longueur plus faible entre les lignées fongiques par rapport à ITS1, ce qui simplifie le traitement bioinformatique et réduit le biais de longueur lors de la PCR. La classification basée sur ITS2 utilisant la base de données UNITE atteint des assignations au niveau des espèces pour 80-90 % des genres fongiques couramment trouvés dans les sols et les environnements associés aux plantes.

Les conditions de PCR sont importantes. L'amplification de l'ITS fongique utilise généralement 25 à 35 cycles. Au-delà de 30 cycles, le risque de formation de chimères augmente considérablement. La température d'annealing est critique : 52-55°C offre le meilleur équilibre entre rendement et spécificité pour ITS1F/ITS4 ; des températures d'annealing plus élevées réduisent le rendement des taxa sous-représentés. Incluez toujours un contrôle sans modèle et au moins un contrôle positif (une communauté fongique simulée avec une composition connue) dans chaque plaque de PCR.

Bioinformatique : Le pipeline UNITE-QIIME 2

La bioinformatique des ITS fongiques diffère de celle des 16S sur deux points importants. Tout d'abord, les amplicons ITS varient en longueur : l'ITS1 d'une espèce fongique peut mesurer 200 pb tandis que l'ITS1 d'une autre peut mesurer 400 pb. Cela signifie que les algorithmes de fusion en paires standard, qui supposent une longueur d'amplicon uniforme, doivent être ajustés. Le flux de travail spécifique aux ITS de DADA2 gère cela en coupant les séquences d'amorces, en filtrant en fonction des scores de qualité, puis en effectuant le débruitage et la fusion avec des contraintes de longueur assouplies.

Deuxièmement, l'attribution de taxonomie contre UNITE utilise un classificateur spécifique aux champignons, soigneusement élaboré. Le classificateur UNITE compatible avec QIIME 2 (disponible sous forme de fichiers .qza pré-entraînés sur le site web d'UNITE) attribue la taxonomie en utilisant le système d'hypothèse dynamique des espèces (SH). Pour la plupart des projets, le classificateur "dynamique UNITE" entraîné sur 97 % des OTUs offre le meilleur équilibre entre résolution et précision. La sortie inclut des identifiants SH (par exemple, SH1234567.08FU) qui lient vos séquences au système de référence UNITE, permettant une comparaison directe entre les études.

La résolution ASV — produisant des variants de séquence d'amplicon plutôt que des clusters OTU — fonctionne pour les données ITS fongiques mais nécessite de la prudence. La région ITS contient des variants intragénomiques au sein d'un seul génome fongique (plusieurs copies d'ADNr avec des séquences ITS légèrement différentes ; les deux noyaux haploïdes dans les champignons dikaryotes peuvent porter des allèles ITS différents), et DADA2 peut les diviser en ASVs séparés. Le post-clustering des ASVs à 97 % d'identité récupère la résolution au niveau des espèces que les écologistes fongiques attendent sans la diversité gonflée des comptes bruts d'ASV.

Figure 2 : Flux de travail de séquençage d'amplicons ITS de bout en bout — De la collecte d'échantillons au profil taxonomique

Communautés fongiques associées au sol et aux racines

Réseaux mycorhiziens : L'économie souterraine

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA, phylum Glomeromycota) forment des symbioses avec environ 80 % des espèces végétales terrestres. Ils étendent le système racinaire des plantes de plusieurs ordres de grandeur, échangeant le phosphore et l'azote du sol contre des photosynthates végétaux. Les champignons ectomycorhiziens (CEM, principalement Basidiomycota et Ascomycota) s'associent à la plupart des espèces d'arbres tempérées et boréales. Les deux groupes sont écologiquement centraux et méthodologiquement difficiles à étudier — les CMA parce qu'ils ne sont pas capturés par des amorces ITS générales, et les CEM parce que le tissu fongique est mélangé avec les cellules racinaires.

Pour les études axées sur les AMF, la stratégie est simple : utiliser des amorces spécifiques aux AMF 18S (AML1/AML2 ou NS31/AML2) pour le composant mycorhizien et des ITS généraux pour la communauté fongique plus large. Pour les études ECM, les amorces ITS générales fonctionnent bien sur les pointes racinaires ectomycorhiziennes qui ont été disséquées individuellement et regroupées, mais les échantillons de racines en vrac seront dominés par des champignons saprotrophes et endophytes.

Les communautés fongiques du sol présentent une hétérogénéité spatiale extrême à l'échelle du centimètre. Un seul gramme de sol forestier peut contenir de l'ADN de plus de 1 000 espèces fongiques, englobant des saprotrophes, des pathogènes et des mutualistes. Pour les études sur les communautés fongiques du sol, l'échantillonnage composite est essentiel : prélevez 5 à 10 carottes de chaque parcelle, homogénéisez et extrayez à partir d'un sous-échantillon représentatif. Pour le sol de la rhizosphère en particulier, prélevez le sol qui reste attaché aux racines après un léger secouage ; c'est le compartiment de la rhizosphère, distinct du sol de masse situé à quelques mètres.

Santé des sols agricoles et biocontrôle

Les communautés fongiques du sol sont de plus en plus utilisées comme indicateurs de la santé des sols agricoles. Les champignons saprotrophes — qui décomposent les résidus de culture et cyclent les nutriments — ont tendance à augmenter sous gestion sans labour et avec les cultures de couverture. Les champignons pathogènes ont tendance à augmenter sous monoculture continue. Le rapport entre les guildes fonctionnelles saprotrophes et pathotrophes, déduit des données ITS à l'aide de FUNGuild ou FungalTraits, fournit un indice quantitatif de la santé du sol qui complète les mesures chimiques.

Trichoderma les espèces sont parmi les champignons de biocontrôle les plus largement étudiés. Elles parasitent les pathogènes fongiques, produisent des métabolites secondaires antimicrobiens et induisent une résistance systémique chez les plantes. Le séquençage ITS d'échantillons de sol en vrac ou de rhizosphère détecte Trichoderma au niveau du genre, mais la résolution au niveau des espèces nécessite Séquençage d'amplicons complets 16S/18S/ITS ou des marqueurs supplémentaires (tef1, rpb2) car la région ITS1 à elle seule ne résout pas le Trichoderma harzianum complexe d'espèces. Pour l'identification au niveau des isolats, Identification microbienne les services intègrent les ITS avec des marqueurs génétiques complémentaires.

Endophytes : La communauté fongique à l'intérieur des feuilles et des tiges

Les endophytes foliaires — des champignons qui vivent de manière asymptomatique à l'intérieur des feuilles et des tiges des plantes — sont parmi les composants les plus divers et les moins compris du microbiome végétal. Ils influencent la tolérance à la sécheresse, la résistance aux herbivores et la susceptibilité aux pathogènes. Le séquençage des amplicons ITS a été l'outil principal pour cataloguer la diversité des endophytes, car la plupart des champignons endophytes ne peuvent pas être cultivés sur des milieux standards.

Le principal défi du profilage ITS des endophytes est la décontamination de surface. Les surfaces des feuilles abritent une abondance de champignons épiphytes (levures, spores de moisissures) qui sont distincts de la communauté endophyte intérieure. La stérilisation de surface avec 2 % d'hypochlorite de sodium (30-60 secondes), 70 % d'éthanol (2 minutes) et trois rinçages à l'eau stérile est standard, mais le temps de traitement doit être calibré selon les espèces de plantes — trop court et les épiphytes persistent, trop long et le stérilisant pénètre dans la feuille, tuant les endophytes. La validation la plus simple : ensemencer l'eau du dernier rinçage sur de l'agar PDA et vérifier la croissance fongique après 5 jours.

Surveillance des agents pathogènes des plantes avec l'ITS

Les agents pathogènes fongiques provoquent une perte de récolte estimée entre 10 et 23 % à l'échelle mondiale, et le changement climatique élargit la répartition géographique de nombreuses espèces. Le séquençage d'amplicons ITS offre deux avantages pour la surveillance des agents pathogènes par rapport aux méthodes traditionnelles : il détecte les agents pathogènes avant l'apparition des symptômes et capture le contexte complet de la communauté fongique dans lequel un agent pathogène évolue.

Pathogènes clés détectables par ITS

Fusarium les espèces (Ascomycota : Hypocreales) causent des flétrissements, des pourritures des racines et des brûlures des épis dans les cultures de céréales, de légumes et ornementales. L'ITS résout le Fusarium genre proprement mais discrimination au niveau des espèces au sein de le F. oxysporum et F. solani les complexes d'espèces nécessitent le facteur d'élongation de la traduction 1-alphatef1) gène. Pour les enquêtes où connaître "Fusarium est présent à X% d'abondance relative" est suffisant, l'ITS fonctionne bien. Pour les études nécessitant lesquelles Fusarium l'espèce est à l'origine de la maladie, associez ITS avec un Fusariummarqueur de codage protéique spécifique.

Verticillium dahliae et V. albo-atrum cause des maladies de flétrissement chez plus de 200 espèces de plantes. L'ITS distingue de manière fiable les deux espèces, ce qui fait de la profilage de l'ITS dans le sol un outil pratique d'évaluation des risques avant la plantation. Un échantillon de sol avec >1% Verticillium L'abondance relative par ITS prédit fortement le développement de la flétrissure dans les cultures sensibles plantées la saison suivante.

Puccinia (les champignons de rouille, Basidiomycota) et d'autres biotrophes obligatoires ne peuvent pas être cultivés sur des milieux artificiels — le séquençage de l'ITS directement à partir de tissus foliaires infectés est la méthode d'identification la plus pratique. Les champignons de rouille ont des régions ITS exceptionnellement grandes (l'ITS1 peut dépasser 500 pb), donc les paires de primers ciblant uniquement l'ITS2 (ITS3/ITS4) produisent une amplification plus cohérente entre les espèces de rouille que les paires de primers full-ITS.

Sols suppressifs de maladies

Certains sols agricoles suppriment naturellement les agents pathogènes fongiques — un phénomène provoqué par des membres antagonistes du microbiome du sol. Le séquençage ITS des sols suppressifs par rapport aux sols favorables a identifié un enrichissement constant de genres fongiques spécifiques.Chaetomium, Clonostachys, et spécifique Trichoderma clades) dans les sols suppressifs. Pour les cultivateurs et les agronomes, le profilage ITS des sols de champ peut identifier les champs avec des communautés fongiques naturellement suppressives qui peuvent nécessiter moins d'intrants fongicides — une application de l'agriculture de précision qui passe de la recherche à la pratique commerciale.

Figure 3 : Communautés fongiques du sol et des racines — Réseaux mycorhiziens et interactions avec les pathogènes

Le mycobiome humain dans la santé et la maladie

Le corps humain abrite des communautés fongiques (le mycobiome) à chaque surface muqueuse : cavité buccale, voies respiratoires, tractus gastro-intestinal, tractus vaginal et peau. Le mycobiome est de loin inférieur en biomasse par rapport au bactériome (les champignons représentent <0,1 % du total des gènes microbiens dans les selles), et cette faible abondance crée des défis techniques uniques pour le profilage basé sur l'ITS.

Mycobiome intestinal

Dans l'intestin humain en bonne santé, Candida, Saccharomyces, et Malassezia les genres fongiques dominants détectés par séquençage ITS, mais la variation interindividuelle est bien plus élevée que pour les bactéries intestinales — le profil fongique intestinal d'une personne est plus proche d'une empreinte digitale que d'un type de communauté conservé. Des études longitudinales montrent que les communautés fongiques intestinales fluctuent de manière plus dynamique que les communautés bactériennes sur des périodes de jours à semaines, reflétant probablement l'apport fongique alimentaire (croûtes de fromage, pain, aliments fermentés) et le passage transitoire de champignons environnementaux.

Pour les études sur le mycobiome intestinal, les protocoles d'extraction d'ADN des selles optimisés pour les bactéries (par exemple, DNeasy PowerSoil Pro) récupèrent adéquatement l'ADN fongique, mais le faible rapport ADN fongique/ADN bactérien signifie que le séquençage des amplicons ITS fongiques nécessite un nombre de cycles PCR plus élevé (35-40 cycles) pour générer un rendement de bibliothèque suffisant. La conséquence est une augmentation de la formation de chimères et du dérive PCR — les répliques biologiques et les témoins négatifs sont plus importants pour l'ITS fongique que pour le 16S bactérien à partir du même échantillon de selles.

Mycobiome respiratoire

L'appareil respiratoire inférieur a longtemps été considéré comme stérile, mais le séquençage de l'irrigation broncho-alvéolaire (BAL) a révélé une communauté fongique à faible biomasse dominée par des champignons environnementaux.Cladosporium, Pénicillium, Aspergillus) chez des individus en bonne santé. Chez les patients atteints de fibrose kystique, d'asthme ou de BPCO, le mycobiome respiratoire se modifie — Aspergillus fumigatus et Candida albicans sont les colonisateurs fongiques les plus courants, et leur présence est associée à un déclin accéléré de la fonction pulmonaire dans la mucoviscidose.

Le principal défi technique pour les études sur le mycobiome respiratoire est de contrôler la contamination des voies respiratoires et des réactifs. La biomasse fongique dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) est de l'ordre des picogrammes, rendant les témoins de extraction et les contrôles sans modèle PCR indispensables. Dans une étude bien contrôlée, les taxons fongiques qui apparaissent dans les contrôles négatifs (typiquement Cladosporium, Alternaria, et Pénicillium — les champignons aéroportés communs) doivent être soustraits ou exclus de l'analyse. Sans cette étape, le mycobiome respiratoire rapporté est principalement un catalogue des contaminants de l'air de laboratoire et des kits.

Mycobiome oral et cutané

Le profilage oral des ITS identifie de manière cohérente Candida en tant que genre fongique dominant dans la cavité buccale, mais Malassezia, Aspergillus, et Fusarium apparaissent également en plus faible abondance. La présence de levures buccales augmente avec l'utilisation de prothèses dentaires, la xérostomie (bouche sèche) et l'immunosuppression. Les échantillons de rinçage buccal ou d'écouvillon de langue fonctionnent bien pour le profilage ITS — aucun dispositif de collecte spécialisé n'est nécessaire, et la charge fongique élevée dans les échantillons buccaux signifie que 25 à 30 cycles de PCR sont suffisants.

Malassezia domine le mycobiome cutané, en particulier sur le visage, le cuir chevelu et le haut du torse — des régions riches en glandes sébacées. Malassezia les espèces sont dépendantes des lipides, et leur abondance est corrélée à la production de sébum. ITS1 est suffisant pour Malassezia identification au niveau des espèces pour les espèces communesM. restricta, M. globosa, M. sympodialis), mais les espèces plus rares du genre bénéficient du séquençage de l'ITS2 ou de l'ITS complet.

Figure 4 : Mycobiome humain — Sites corporels clés et taxons fongiques dominants par profilage ITS

Choisir votre stratégie ITS

ITS1 contre ITS2 : Recommandation finale

Choisissez ITS1 (paire d'amorces ITS1F/ITS2) si votre étude cible les Basidiomycètes (rouilles, charbon, champignons ECM, champignons de décomposition du bois), si vous avez besoin d'une compatibilité maximale avec le plus grand nombre de jeux de données ITS publiés, ou si vos échantillons sont associés au sol ou aux plantes où la diversité des Basidiomycètes est élevée.

Choisissez ITS2 (paire d'amorces ITS3/ITS4 ou ITS3N/ITS4N) si votre étude cible les Ascomycètes (moisissures, agents pathogènes des plantes, levures), si vous travaillez avec le mycobiome humain où la plupart des champignons cliniquement pertinents sont des Ascomycètes, ou si vous privilégiez la variation de longueur d'amplicon plus faible qui simplifie le traitement bioinformatique.

Choisissez l'ITS complet (ITS1F/ITS4) si vous avez besoin d'une largeur taxonomique maximale à travers tous les phylums fongiques et que votre plateforme de séquençage prend en charge des amplicons jusqu'à 700 bp (MiSeq v3 2×300 bp avec chevauchement ; PacBio ; Nanopore).

Figure 5 : Cadre de décision ITS1 vs ITS2 — Choisir la bonne stratégie d'amplicon

Profondeur de séquençage et répliques biologiques

Les bibliothèques ITS fongiques de la plupart des types d'échantillons atteignent la saturation à 50 000-100 000 lectures par échantillon, similaire au 16S bactérien. Les échantillons de sol, qui contiennent les communautés fongiques les plus diversifiées, peuvent nécessiter 100 000-150 000 lectures pour la saturation de la courbe de raréfaction.

Les exigences en matière de réplicats biologiques reflètent celles pour le 16S : 5 à 8 par groupe pour les études sur les plantes en environnement contrôlé (avec pot ou parcelle comme unité expérimentale), 20 à 30 par groupe pour les études mycobiomes humaines transversales, et 8 à 12 par traitement pour les études agricoles à l'échelle de terrain. Les réplicats techniques ajoutent généralement peu d'informations pour l'ITS, comme c'est le cas pour le 16S.

Facteurs de coût et planification budgétaire

Le coût par échantillon du séquençage d'amplicons ITS a considérablement diminué, mais le coût total va au-delà du séquençage lui-même. Lors de l'établissement d'un budget pour un projet ITS, les principaux postes de dépenses sont l'extraction d'ADN (plus élevée pour les échantillons de sol et de plantes nécessitant un nettoyage supplémentaire), l'amplification par PCR et la préparation de la bibliothèque (un amplicon pour l'ITS seul, deux amplicons pour l'ITS + 16S), la profondeur de séquençage (50K-150K lectures par échantillon selon le type d'échantillon) et l'analyse bioinformatique (classification taxonomique standard UNITE vs. prédictions fonctionnelles personnalisées). À titre indicatif pour le budget de subvention : un projet ITS seul de 50 échantillons avec extraction d'ADN de sol standard et bioinformatique de base se situe généralement dans une fourchette de 50 à 100 $ par échantillon dans la plupart des CRO, tandis qu'un projet dual ITS + 16S ajoute 30 à 50 % au coût par échantillon.

Remarque : Les prix exacts dépendent du type d'échantillon, de la qualité de l'ADN et du niveau d'analyse. Demandez toujours un devis tout compris couvrant l'extraction jusqu'à la bioinformatique, et confirmez que les échantillons sont randomisés à travers les plaques de séquençage pour éviter les effets de lot.

Intégration des ITS avec le 16S et d'autres approches

Un nombre croissant d'études séquencent à la fois l'ITS et le 16S à partir des mêmes échantillons — profils de communautés fongiques et bactériennes à partir du même extrait d'ADN, amplifiés avec des ensembles de primers séparés. Cette approche à double marqueur capture l'ensemble de la communauté microbienne et révèle les interactions fongiques-bactériennes que ni l'un ni l'autre des marqueurs ne peut détecter seul. Lors de la planification d'une étude duale ITS + 16S, extrayez suffisamment d'ADN pour le diviser en deux aliquotes pour une amplification PCR séparée, plutôt que d'essayer de multiplexe les deux ensembles de primers dans une seule réaction.

Un projet dual ITS + 16S avec 50 échantillons coûte généralement 30 à 50 % de plus qu'un projet à marqueur unique de la même taille — le coût supplémentaire provient de la seconde amplification PCR, de la seconde préparation de bibliothèque et de la profondeur de séquençage supplémentaire nécessaire pour obtenir une couverture adéquate pour les deux amplicons. Cependant, le coût combiné par échantillon pour les deux marqueurs reste bien en dessous d'un métagénome shotgun peu profond (5 millions de lectures par échantillon), ce qui fait du séquençage d'amplicon à double marqueur l'approche la plus économique pour un profilage complet des communautés bactériennes et fongiques. Lors de la demande de devis auprès d'un CRO, confirmez que les deux amplicons peuvent être séquencés sur le même flux de cellules pour maximiser l'efficacité des coûts, et précisez si l'analyse bioinformatique pour les deux marqueurs (UNITE pour ITS, SILVA pour 16S) est incluse dans le package d'analyse standard ou facturée séparément.

Si votre question nécessite une annotation fonctionnelle — que font ces champignons ? — la taxonomie ITS à elle seule ne répondra pas à cela. Séquençage shotgun métagénomique capture des génomes fongiques aux côtés des génomes bactériens, fournissant une annotation fonctionnelle directe des gènes, y compris des profils d'enzymes actives sur les glucides (CAZy) et des clusters de gènes de biosynthèse de métabolites secondaires. Pour les études d'interaction plante-fongique où le transcriptome de l'hôte est également d'intérêt, RNA-Seq capture à la fois l'expression des gènes des plantes et l'expression des gènes des champignons à partir de tissus infectés simultanément. Si vous avez besoin d'une résolution au niveau des espèces au-delà de ce que fournit l'ITS standard — pour résoudre des complexes d'espèces dans Fusarium, Trichodermaou Candida — Séquençage d'amplicons complets 16S/18S/ITS L'utilisation des plateformes PacBio ou Nanopore comble l'écart de résolution.

Pour une perspective plus large sur la façon dont l'ITS s'intègre dans le paysage du séquençage d'amplicons multi-marqueurs — y compris le 16S pour les bactéries, le 18S pour les protistes et le codage ADN pour l'identification des espèces — voir l'article. Services de séquençage d'amplicons pour la recherche sur le microbiome et la biodiversité : solutions 16S, 18S, ITS et de codage ADN.Pour l'identification au niveau des espèces des isolats fongiques individuels (plutôt que le profilage communautaire), les services de séquençage ADN pour l'identification des espèces : COI, rbcL, matK, et au-delà, offrent des approches complémentaires.

CD Genomics Services de séquençage d'amplicons soutenir à la fois des projets à marqueur unique (ITS ou 16S) et à double marqueur, avec des pipelines bioinformatiques standardisés UNITE + SILVA et des options d'analyse personnalisées pour les études de communautés fongiques. Pour les chercheurs qui ont besoin d'une abondance fongique absolue plutôt que de proportions relatives, Séquençage d'Amplicon Quantitatif Absolu 16S/18S/ITS ajoute des standards de spike-in pour convertir les comptes de lecture ITS en nombres absolus de cellules fongiques par échantillon.

FAQ

Q : Quel est le meilleur pour le profilage de la communauté fongique — ITS1 ou ITS2 ?

L'ITS1 offre une meilleure résolution pour les Basidiomycètes ; l'ITS2 pour les Ascomycètes. Pour une couverture équilibrée à travers le royaume fongique, l'ITS complet (ITS1F/ITS4, ~450-700 pb) est le meilleur choix. Si des contraintes techniques limitent la longueur de l'amplicon, l'ITS2 (~250-350 pb) offre une variation de longueur plus faible et une amplification plus uniforme à travers les lignées fongiques.

Q : Les amorces ITS générales peuvent-elles détecter les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) ?

Non, pas de manière fiable. Le primer ITS1F largement utilisé présente des incompatibilités avec les Glomeromycota. Pour les études axées sur les AMF, utilisez des primers spécifiques 18S pour les AMF (AML1/AML2 ou NS31/AML2) en parallèle avec des primers ITS généraux pour la communauté fongique plus large.

Q : Comment puis-je empêcher l'ADN des plantes de dominer mes bibliothèques ITS fongiques racinaires ?

Stérilisez les racines en surface avec une solution de 2 % d'hypochlorite de sodium (30 à 60 secondes), rincez à l'eau stérile et extrayez l'ADN directement à partir du tissu racinaire. Les amorces ITS n'amplifient pas l'ADN des plantes (les plantes manquent de l'opéron rDNA fongique), mais les composés végétaux co-extraits (polyphénols, polysaccharides) peuvent inhiber la PCR. Un nettoyage post-extraction avec du PVP ou des billes SPRI améliore l'amplification à partir des extraits d'origine végétale.

Q : Quels contrôles négatifs sont essentiels pour le séquençage de l'ITS fongique ?

Les mêmes trois contrôles que pour le 16S : blanc d'extraction (contrôle sans échantillon traité tout au long du processus d'extraction), blanc PCR (eau de qualité moléculaire substituée au modèle d'ADN) et blanc de terrain (un écouvillon stérile ou un dispositif de collecte exposé à l'environnement d'échantillonnage). Les projets d'ITS fongiques sont particulièrement sensibles à la contamination par des spores aériennes — Cladosporium, Pénicilliumet Alternaria apparaissent couramment dans les contrôles négatifs.

Q : Combien de lectures par échantillon ai-je besoin pour l'ITS ?

50 000-100 000 pour la plupart des types d'échantillons. Échantillons de sol à la limite supérieure (100 000-150 000). Échantillons de mycobiome humain (selles, peau, oral) à la limite inférieure (30 000-50 000) en raison d'une diversité fongique plus faible.

Q : Puis-je utiliser le même extrait d'ADN pour le séquençage ITS et 16S ?

Oui. L'ADN extrait avec des protocoles de battement de billes (par exemple, DNeasy PowerSoil Pro) récupère à la fois l'ADN bactérien et fongique. Divisez l'extrait en deux aliquotes pour une amplification PCR séparée de l'ITS et du 16S. Ne multiplexez pas les deux ensembles de primers dans une seule réaction PCR — les primers vont interférer les uns avec les autres.

Q : Quelle est la fiabilité de l'ITS pour l'identification des champignons cliniques au niveau des espèces ?

Fiable pour les champignons cliniques courants (Candida albicans, C. glabrata, Aspergillus fumigatus, A. niger, Cryptococcus neoformans) lors de l'utilisation d'UNITE comme base de données de référence. Pour les champignons cliniques moins courants ou les complexes intra-espèces (par exemple, Candida parapsilosis complexe), l'ITS peut ne résoudre qu'au niveau du genre ou du complexe d'espèces.

Q : Quel pipeline de bioinformatique devrais-je utiliser pour les données ITS fongiques ?

DADA2 avec le flux de travail spécifique à l'ITS (tailler les amorces, filtrer, débruiter, fusionner avec des contraintes de longueur assouplies), suivi de l'attribution de taxonomie contre le classificateur dynamique UNITE (format .qza compatible QIIME 2). Post-cluster ASVs à 97 % d'identité pour regrouper les variants intragénomiques en unités au niveau des espèces.

Références :

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À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.