L'introduction et le flux de travail du séquençage de bibliothèque préfabriquée

Qu'est-ce que le séquençage de bibliothèque préfabriquée ?

Pour séquençage de nouvelle générationDes séquençages entièrement automatisés à un coût par base inférieur et des temps d'essai plus rapides sont désormais disponibles grâce aux instruments de haute capacité et de banc récemment introduits. En conséquence, un goulot d'étranglement important a été détecté dans le processus complexe et chronophage de préparation des bibliothèques, qui commence par des acides nucléiques isolés et se termine par de l'ADN amplifié et étiqueté avec des adaptateurs de séquençage. Les protocoles de préparation des bibliothèques sont généralement des processus en plusieurs étapes qui nécessitent des réactifs coûteux et beaucoup de temps de manipulation. Pour garantir la robustesse et la reproductibilité, une forte insistance sur la normalisation sera nécessaire.

Séquençage de bibliothèque préfabriquée est commun séquençage à haut débit approche utilisée pour analyser les informations génomiques dans des échantillons d'ADN. L'accent principal sur séquençage pré-bibliothèque réside dans la préparation de bibliothèques d'ADN, qui contiennent des fragments d'ADN préparés prêts pour le séquençage. Ces fragments d'ADN proviennent généralement de divers échantillons utilisés dans la recherche biologique. Séquençage pré-bibliothèque peut être effectué à l'aide de séquençage de deuxième génération des plateformes ainsi que des plateformes de séquençage de troisième génération comme Séquençage SMRT de PacBio et Séquençage par nanopores.

Quel est le flux de travail du séquençage de bibliothèque préfabriquée ?

Préparation des bibliothèques de séquençage :

Figure 1. Flux de travail de base pour la préparation de bibliothèques NGS. (Head et al., 2014)

• Bibliothèques de séquençage d'ADN et d'ARN

En commençant par l'ADN génomique ou l'ARN, une bibliothèque de séquençage peut être créée. Le flux de travail pour créer un Séquençage de l'ADN la bibliothèque se compose de trois étapes fondamentales :
- Fragmentation et dimensionnement des acides nucléiques (ADN ou ARN) pour obtenir des fragments d'une longueur prédéterminée,
- Connexion des adaptateurs aux extrémités du fragment, et
- Quantification de la bibliothèque.

Il y a une étape supplémentaire dans n'importe quel Séquençage de l'ARN bibliothèque : conversion de l'ARN en cDNA. La procédure de fragmentation peut être effectuée avant ou après la synthèse du cDNA.

• Fragmentation

Des méthodes physiques, des méthodes enzymatiques et des méthodes chimiques peuvent toutes être utilisées pour fragmenter les acides nucléiques (ADN, ARN ou ADNc). Les techniques les plus fréquemment utilisées sont les méthodes physiques et enzymatiques. En particulier, de longs fragments peuvent être obtenus pour les bibliothèques mate-pair (6 000 à 20 000 pb).

• Taille des fragments

La taille des fragments est extrêmement importante. La taille idéale des fragments de bibliothèque est déterminée par la plateforme à utiliser et l'étendue de l'analyse. Sur les plateformes Illumina, par exemple, des fragments allant jusqu'à 1 500 pb peuvent être utilisés dans le cas de séquençage de l'exomeCependant, une taille d'insertion maximale de 200-250 pb est suggérée. Cela est dû à la taille moyenne d'un exon humain qui est de 200 paires de bases.

• Fixation des adaptateurs

Les soi-disant adaptateurs doivent être fixés aux deux extrémités de chaque fragment une fois que la fragmentation de l'ADN ou de l'ARN est complète. Par définition, une bibliothèque de séquençage est une collection de fragments d'ADN avec des adaptateurs connectés. Les adaptateurs sont conçus pour fonctionner avec une plateforme de séquençage spécifique, comme la surface de la cellule de flux ou les billes. Après l'attachement des adaptateurs, une phase de taille a lieu, au cours de laquelle tous les fragments de taille indésirable et tous les dimères d'adaptateurs sont éliminés. Les dimères d'adaptateurs se forment lorsque les adaptateurs s'auto-ligament sans séquence d'insertion de bibliothèque, et ils sont particulièrement courants lorsque la quantité initiale d'ADN est faible. Il est essentiel d'éliminer les dimères d'adaptateurs de la bibliothèque car ils peuvent réduire considérablement le rendement du séquençage en consommant un espace précieux sur la cellule de flux. Un nettoyage avec des billes magnétiques peut efficacement effacer les dimères.

• Quantification de la bibliothèque

La quantification des bibliothèques est une étape critique qui doit être réalisée en utilisant la méthode la plus précise et pratique possible. Les méthodes basées sur la PCR (PCR numérique ou PCR quantitative) sont couramment utilisées pour quantifier les bibliothèques de séquençage.

• La qualité finale de la bibliothèque de séquençage

Lors de la création d'une bibliothèque de séquençage, il est essentiel de viser le niveau de complexité le plus élevé possible. En d'autres termes, il est crucial que la bibliothèque finale capture autant que possible l'unicité du matériel original. Limiter le nombre de duplications segmentaires est la première étape pour atteindre ce résultat. Plus les fragments sont courts, plus ils ont de chances d'être moins spécifiques et de s'aligner à plusieurs loci dans la séquence de référence. En conséquence, le pourcentage de lectures dupliquées dans les données de séquençage peut être utilisé pour déterminer la complexité de la bibliothèque.

Séquençage :

Après avoir subi des procédures de contrôle de qualité et d'amplification, la bibliothèque d'ADN est traitée pour séquençage à haut débit sur un séquenceur. Le séquençage de bibliothèques préfabriquées utilise généralement des plateformes telles qu'Illumina, qui ont la capacité de produire une quantité substantielle de courtes lectures de séquences.

Analyse des données :

À l'issue du séquençage de la bibliothèque, les données de séquence résultantes sont transférées vers un système informatique pour bioinformatique analyse. Le processus analytique englobe des activités séquentielles, y compris le contrôle de qualité des séquences, l'alignement des séquences et l'identification des variants. Au cours de la phase de contrôle de qualité, les données de séquence originales subissent une filtration pour exclure les séquences de faible qualité. Par la suite, grâce à l'alignement avec un génome de référence ou un assemblage de génome, les attributs source et positionnels des séquences d'ADN peuvent être discernés. En fin de compte, des mécanismes comme la détection de variants permettent d'identifier les modifications génétiques au sein de l'échantillon, telles que les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ou les variations structurelles (SV), révélant ainsi les informations génétiques caractéristiques de l'échantillon d'ADN.

Conclusion

Séquençage de bibliothèque préfabriquée joue un rôle essentiel dans diverses études génomiques. Il sert de pierre angulaire dans séquençage du génome, facilitant l'acquisition rapide de données de séquence génomique complète de haute qualité et faisant progresser la recherche génomique chez les humains, les plantes, les animaux et d'autres organismes. Dans séquençage du transcriptome, séquençage de bibliothèque préfabriquée décode de manière exhaustive les profils d'expression génique, aidant les chercheurs à comprendre les mécanismes de régulation des gènes dans différentes conditions.

De plus, séquençage de bibliothèque préfabriquée a des applications significatives dans épigénomique recherche. Elle est utilisée pour analyser les marqueurs épigénétiques tels que la méthylation de l'ADN, les modifications des histones, révélant le réseau complexe de la régulation de l'expression génique. Dans le domaine du génotypage et de la détection des variants, séquençage de bibliothèque préfabriquée excelle en détectant avec précision les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) et les variations structurelles (SV), offrant un soutien de données crucial pour la médecine personnalisée et la recherche sur les maladies.

En conclusion, séquençage de bibliothèque préfabriquée se distingue comme une méthode robuste et efficace en termes de temps pour analyser les génomes à travers divers spécimens biologiques. Son flux de travail simplifié, commençant par la construction de bibliothèques d'ADN et se terminant par des analyses bioinformatiques, permet une caractérisation génomique rapide et précise. En contournant des procédures de préparation d'échantillons étendues, séquençage de bibliothèque préfabriquée diminue les écarts expérimentaux et réduit la consommation de ressources.

CD Genomics propose séquençage de bibliothèque préfabriquée services, utilisant des plateformes de séquençage avec des capacités et des longueurs de lecture variées pour répondre à des besoins de recherche divers. De plus, nous proposons une vaste gamme de services de séquençage, y compris Séquençage génomique, Séquençage du transcriptome, Séquençage épigénomique, et GénotypageNotre équipe de professionnels qualifiés est dédiée à fournir un soutien et une assistance exceptionnels, garantissant le succès de vos projets de recherche.

Références :

1. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, et al. Préparation de bibliothèque pour le séquençage de nouvelle génération : un examen des stratégies d'automatisation. Avancées en biotechnologie. 1 juil. 2020 ;41.
2. Head SR, Komori HK, LaMere SA, et al. Construction de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération : aperçus et défis. BiotechniquesFév 2014 ; 56(2).
3. Robin JD, Ludlow AT, LaRanger R, et al. Comparaison des méthodes de quantification de l'ADN pour le séquençage de nouvelle génération. Rapports scientifiques2016 avr. 6;6(1).