Protocole de séquençage de l'ADN libre de cellules plasmatiques

1. Collectez 5 mL de sang périphérique en utilisant des tubes de sang EDTA séparés.
2. Extraire le plasma maternel par une procédure de centrifugation en deux étapes dans les 8 heures suivant la collecte de sang. En bref, centrifuger le sang maternel initialement à 1600×g pendant 10 minutes à 4°C, puis transférer 1 ml de surnageant dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml pour une seconde centrifugation à 16000×g pendant 10 minutes à 4°C. Ensuite, transférer la majeure partie du plasma maternel dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml. Faites attention à ne pas retirer de couche leucocytaire ni de débris au fond lors du transfert du plasma maternel.
3. Extraire l'ADNc circulant à partir de 300μL de plasma maternel en utilisant un kit d'isolement de l'ADN circulant conformément aux instructions du fabricant. Mélanger brièvement 20μL de protéinase K et 25μL de Pure Particle G avec 300μL de plasma maternel dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml. Mélanger soigneusement et ajouter 550μL de tampon de lyse. Vortexer brièvement et placer le tube Eppendorf sur un dispositif de séparation magnétique pendant 15 minutes à température ambiante.
4. Retirez soigneusement tout le surnageant et mélangez les billes restantes avec 700 μL de Tampon de Lavage 1. Vortexez brièvement et placez le tube Eppendorf sur un dispositif de séparation magnétique pendant 1 minute.
5. Retirez soigneusement tout le surnageant et mélangez les billes restantes avec 700 μL de Tampon de Lavage 2 (assurez-vous que de l'éthanol a été ajouté). Vortexez brièvement et placez le tube Eppendorf sur un dispositif de séparation magnétique pendant 1 minute.
6. Retirez soigneusement tout le surnageant et répétez le lavage avec 700 μL de Tampon de Lavage 2. Placez le tube Eppendorf sur un dispositif de séparation magnétique pour retirer soigneusement tout le surnageant, puis laissez à température ambiante sécher pendant 10 minutes.
7. Ajoutez 50 μL de tampon d'élution, vortexez brièvement, puis laissez à température ambiante pendant 5 minutes. Placez le tube Eppendorf sur un dispositif de séparation magnétique et transférez le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf.
8. Déterminez la quantification de l'ADNcf plasmatique extrait à l'aide d'un kit Qubit ds DNA HS Assay, et déterminez la taille des fragments d'ADN à l'aide d'un kit Agilent 2100 sur une plateforme Bioanalyzer 2100. L'ADNcf plasmatique doit présenter un pic de fragments à 166–170 pb.
9. Construisez la bibliothèque d'ADN libre circulant (cfDNA) en utilisant un ensemble de préparation de bibliothèque d'ADN libre selon les instructions du fabricant. Utilisez 5 ng de cfDNA pour effectuer la réparation des extrémités et l'ajout d'une queue A. Des adaptateurs avec des codes-barres spécifiques sont ligaturés aux fragments de cfDNA, puis le produit de ligature est purifié avec les billes de purification fournies.
10. Après nettoyage, l'ADN est amplifié par 12 cycles de PCR et une autre ronde de purification selon les instructions du kit. Quantifiez les produits de PCR avec le kit d'évaluation dsDNA HS. Le rendement requis pour les produits de PCR est ≥2 ng/μL.
11. Dénaturez les produits de PCR par la chaleur à 95 °C pendant 3 minutes dans un thermocycleur PCR. Mélangez l'ADN dénaturé avec le mélange de réaction de circularisation et incubez à 37 °C pendant 30 minutes pour créer des cercles d'ADN simple brin.
Utilisez 20 μL du produit ssDNA circulé pour le séquençage conformément au manuel d'instructions du jeu de séquençage à haut débit.
13. Quantifiez 2 μL de DNBs en utilisant le kit d'analyse ssDNA et le fluoromètre Qubit. Une concentration minimale de 8 ng/μL est requise.
14. Charge chaque préparation de DNB sur une voie séparée pour être traitée pour un séquençage pair à 100 pb (PE) conformément au protocole du fabricant. D'autres instruments de séquençage peuvent être utilisés, mais les oligonucleotides de séquençage et les conditions devront être modifiés.