Directives de Soumission d'Échantillons
Séquençage de méthylation HiFi PacBio : Questions et réponses
Questions Générales
- Comment PacBio HiFi peut-il réaliser la détection de la méthylation ?
- Séquençage PacBio possède 4 étiquettes fluorescentes, qui sont marquées avec 4 types de dNTP, et sa polymérase est ancrée au fond de la puce de séquençage ; lorsque le brin d'ADN se lie à l'enzyme, le séquençage est effectué, et pendant le séquençage, le dNTP fluorescent forme un complexe avec l'enzyme et le modèle d'ADN, qui se liera brièvement. Au cours de ce processus, lorsque la polymérase rencontre des bases méthylées A, C et d'autres sur le modèle, le taux de polymérisation sera significativement plus lent. Les caractéristiques spectrales correspondantes changeront, ce qui permet de mesurer directement la méthylation de l'A, la méthylation du C, l'hydroxyméthylation du C, etc.
- Comment obtenir des informations sur la méthylation 5mC à partir de données de séquençage HiFi ?
- Pour obtenir des informations sur la méthylation 5mC à partir des données HiFi, il y a deux cas : l'un concerne les données HiFi mesurées précédemment, et l'autre concerne les données HiFi prêtes à être mesurées.
- Après avoir obtenu le fichier 5mC, comment puis-je effectuer des analyses ultérieures ?
- Séquençage HiFiLe fichier bam après l'analyse primrose représente les informations de méthylation de la séquence du génome entier. Sur cette base, nous devons d'abord le comparer avec le génome de référence (en utilisant le logiciel minimap), puis utiliser le logiciel pb-CpG-tools pour obtenir les informations de probabilité de méthylation à une certaine position sur le génome après avoir obtenu le fichier bam aligné après comparaison.
- Combien de profondeurs de séquençage sont nécessaires pour la détection HiFi de 5mC ?
- Selon les résultats des tests officiels, lorsque les données HiFi sont supérieures à 10×, les résultats de méthylation basés sur la détection des données HiFi sont en bon accord avec les résultats WGBS, et le coefficient de corrélation tend à se stabiliser progressivement avec l'augmentation de la profondeur de séquençage. Par conséquent, la détection HiFi de 5mC et une profondeur de séquençage de 10-15× sont suffisantes.
- Que dire de la sensibilité et de la précision de la détection HiFi de 5mC ?
- En utilisant des échantillons humains comme données de test, nous avons comparé la cohérence de WGBS, ONT, HiFi, etc. pour détecter 5mC, et les résultats ont montré que le coefficient de corrélation entre les résultats des tests HiFi et les autres résultats de tests était supérieur à 90 %, ce qui a confirmé la sensibilité et la précision de HiFi pour détecter 5mC.
- Quels sont les avantages de la détection HiFi 5mC par rapport à d'autres technologies de détection ?
- Les technologies de détection de la méthylation existantes ont soit une longueur de lecture trop courte, soit ne sont pas suffisamment précises en séquençage, et il est difficile de distinguer les informations de méthylation des haplotypes. HiFi 5mC, en revanche, hérite des avantages des technologies de détection mentionnées ci-dessus, mais peut également distinguer les informations de méthylation des haplotypes, rendant possible l'analyse des différences de méthylation au niveau des haplotypes.
- Quelles applications la détection HiFi de la méthylation 5mC peut-elle avoir ?
- Comme mentionné ci-dessus, la détection HiFi de méthylation 5mC les données ont des exigences de profondeur faibles, une large couverture et peuvent être phasées en méthylation, ce qui nous permet de mesurer les données HiFi une fois pour compléter à la fois l'assemblage du génome et la détection des variants ainsi que l'analyse de la méthylation, ce qui peut fournir une aide complète pour la résolution approfondie des espèces. De plus, sur la base des résultats du phasage de méthylation, nous pouvons explorer la méthylation différentielle des allèles, retracer l'imprégnation parentale et rechercher des gènes imprimés, ce qui aidera les chercheurs à analyser le mécanisme génétique du développement des espèces, des causes de maladies et des phénotypes importants dans une dimension supérieure.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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