Protocole de séquençage métatranscriptomique

Extraction d'ARN

Extraction d'ARN à partir de sol ou de sédiment

1. 0,5 g (poids humide) de sol est ajouté à un tube de microcentrifuge de 2 ml.
2. 0,5 ml de tampon bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB) et 0,5 ml de phénol-chloroforme-alcool isoamyle (25:24:1) (pH 8,0) sont ajoutés à chaque extraction.
3. Agitez les tubes dans un système de batteur à billes pendant 30 s à 5,5 m/s.
4. La phase aqueuse est séparée par centrifugation (16 000 × g) pendant 5 min à 4°C.
5. La phase aqueuse est ajoutée à un volume égal de chloroforme-alcool isoamyle (24:1).
6. L'échantillon est centrifugé à (16 000 × g) pendant 5 min à 4°C.
7. L'ADN et l'ARN sont précipités de la couche aqueuse avec 2 volumes de polyéthylène glycol 6000 à 30 % (poids/volume) et 1,6 M de NaCl pendant 2 h à température ambiante, suivi d'une centrifugation à 18 000 × g, 4°C pendant 10 min.
8. Le culot d'acides nucléiques est ensuite lavé avec de l'éthanol à 70 % (volume/volume) à froid par centrifugation à 10 000 × g pendant 20 min.
9. Les acides nucléiques sont ensuite séchés à l'air pendant 15 min avant d'être resuspendus dans 1000 ml de tampon Tris-EDTA sans RNase.
10. 100 ml de l'ARN total doivent être purifiés avec du β-mercaptoéthanol ajouté au tampon RLT.
11. La concentration approximative d'ARN est déterminée par spectrophotométrie et vérifiée pour l'intégrité de l'ARNr. L'intégrité de l'ARNr a été démontrée par des pics d'ARNr très définis et discrets, le pic de l'ARNr 23S étant 1,5 à 2 fois plus élevé que le pic de l'ARNr 16S.
12. La contamination par l'ADN a été éliminée des échantillons d'ARN total par traitement avec l'enzyme Turbo sans ADN.

Extraction d'ARN à partir d'eau de mer

1. Filtrer 10 à 15 L d'eau de mer à travers un filtre GF/A de 140 mm de diamètre et 1,6 mm pour réduire l'abondance des cellules eucaryotes et maximiser la proportion de cellules procaryotes.
2. Appliquer le filtrat directement sur un filtre Sterivex de 0,22 mm.
3. Après filtration, chaque Sterivex a été pompé à sec et congelé dans de l'azote liquide.
4. Après décongélation sur glace, ajouter 1,6 ml de tampon de lyse SET directement sur le Sterivex à l'aide d'une seringue de 2,5 ml.
5. Ajouter 180 ml de lysozyme frais et sceller le Sterivex.
6. Incuber à 37°C pendant 30 min.
7. Ajouter 200 ml de SDS.
8. Ajouter 55 ml de protéinase K fraîche à 20 mg/ml.
9. Incuber à 55°C pendant 2 h.
10. Retirer le lysat dans une seringue de 5 ml.
11. Ajouter 1 ml de tampon SET frais au Sterivex et faire tourner pour rincer.
12. Retirer le tampon de rinçage dans la même seringue de 5 ml.
13. Ajouter le lysat dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de phénol-chloroforme-alcool isoamyle (25:24:1), pH 8. Agiter doucement jusqu'à mélange puis centrifuger à 1 500 × g pendant 5 min.
14. Ajouter 2 ml supplémentaires de phénol-chloroforme-alcool isoamyle (25:24:1). Agiter doucement jusqu'à mélange et centrifuger à 1 500 × g pendant 5 min.
15. Ajouter 2 ml de chloroforme-alcool isoamyle (24:1). Agiter doucement jusqu'à mélange et centrifuger à 1 500 × g pendant 5 min.
16. Décanter la phase aqueuse dans un tube de centrifugeuse stérile et traité au DEPC (si l'ARN est nécessaire) de 20 ml et ajouter 0,5 V de l'acétate d'ammonium à 7,5 M. Mélanger brièvement puis ajouter 2,5 V d'éthanol pur.
17. Mélanger et laisser à -20°C pendant plus d'1 h (une nuit est acceptable).
18. Centrifuger à 10 000 × g pendant 30 min à 4°C et décanté l'éthanol.
19. Ajouter 2 ml d'éthanol à 80 % et rincer le tube, puis centrifuger à 10 000 × g pendant 20 min à 4°C et décanté l'éthanol, et répéter.
20. Décanter l'éthanol et laisser inversé pendant 15 min dans une hotte.
21. Suspendre le culot dans 200 ml d'eau stérile traitée au DEPC. Laisser sur glace pendant environ 1 h avec des tapotements fréquents pour rincer les parois du tube.

Techniques d'enrichissement de l'ARNm

1. L'ARN total a été appliqué à la méthode d'hybridation soustractive pour éliminer l'ARNr de l'ARNm. Les instructions du fabricant fournissent suffisamment de détails pour réaliser cette procédure.
2. L'ARNm a été éluté dans 25 ml de tampon TE.
3. Éliminer les petits ARN et les petites contaminants, selon les instructions du fabricant. L'ARNm purifié a été éluté dans 10 ml d'eau traitée au DEPC.
4. L'ARNm a ensuite été transcrit inversement en ADNc à l'aide d'une enzyme avec des amorces aléatoires selon les instructions du fabricant pour la transcription avec amorces aléatoires.
5. L'ADNc a été traité avec de la RNase pour éliminer les traces de contaminants d'ARN, en incubant à 37°C pendant 20 min.
6. 1 ml d'ADNc a ensuite été amplifié de manière aléatoire. Idéalement, cette réaction est réalisée 10 fois, puis ces répliques sont regroupées pour éliminer le biais potentiel d'amplification aléatoire inhérent à la technologie d'amplification par déplacement multiple.
7. Les échantillons amplifiés sont traités avec de la nucléase S1 à 2 m/mg d'ADNc. La réaction est incubée dans le tampon fourni à 37°C pendant 30 min. La réaction est arrêtée en ajoutant 20 mM de concentration finale d'EDTA puis nettoyée.
8. L'ADNc a été nébulisé puis nettoyé avec des billes AMPure.
9. L'ADNc a ensuite été séquencé.

Référence :

1. Gilbert J A, Laverock B, Temperton B, et al. Métagénomique[M]//Séquençage de nouvelle génération à haut débit. Humana Press, Totowa, NJ, 2011 : 173-183.