Directives de Soumission d'Échantillons
Séquençage de métagénome Q&R
Questions générales
- Quelles sont les différences entre le métagénome et la diversité microbienne ?
- (1) Différence expérimentale : La diversité microbienne cible principalement l'amplification et le séquençage des séquences de gènes de la petite sous-unité ribosomique (16s rDNA ou 18s rDNA), tandis que séquençage de métagénome nécessite uniquement la fragmentation de l'ADN obtenu par extraction.
(2) Différences analytiques : Le séquençage de la diversité microbienne nécessite un regroupement des OTU et ne peut étudier que la classe et le ratio de composition des espèces, tandis que le séquençage du métagénome nécessite un assemblage et une évaluation des séquences, et peut être analysé et étudié simultanément aux niveaux des espèces, des gènes et des fonctions. En résumé, la diversité microbienne nous indique principalement quels micro-organismes se trouvent dans l'environnement, tandis que les métagénomes nous informent principalement sur ce que ces micro-organismes peuvent faire dans l'environnement.
- (1) Différence expérimentale : La diversité microbienne cible principalement l'amplification et le séquençage des séquences de gènes de la petite sous-unité ribosomique (16s rDNA ou 18s rDNA), tandis que séquençage de métagénome nécessite uniquement la fragmentation de l'ADN obtenu par extraction.
- Comment choisir entre le séquençage du métagénome ou l'analyse de la diversité ?
- Le choix dépend de l'objectif de votre étude. Si vous vous concentrez uniquement sur la composition de la communauté de l'environnement, y compris quels genres dominants et non dominants, alors la diversité microbienne est suffisante. Si vous devez explorer des informations fonctionnelles plus approfondies basées sur la composition de la communauté, alors le séquençage du métagénome est recommandé. Alternativement, une grande taille d'échantillon peut être utilisée pour l'analyse de la diversité microbienne, et des échantillons appropriés peuvent être sélectionnés pour le séquençage du métagénome en fonction des résultats de l'analyse de diversité afin d'explorer les propriétés fonctionnelles des espèces de la communauté de manière plus approfondie.
- Quelle est la différence entre le métagénome et le métatranscriptome ?
- Le métagénome est l'étude de l'ADN de tous les micro-organismes dans l'environnement, et métatranscriptomique C'est l'étude de l'ARN de tous les microorganismes dans l'environnement. Le métagénome nous indique ce que tous les microorganismes dans l'environnement peuvent faire, et le métatranscriptome nous dit ce que tous les microorganismes dans l'environnement sont en train de faire.
- Comment réaliser un assemblage de métagénome ?
- Après avoir obtenu la séquence du métagénome, il est nécessaire de réaliser une analyse de contrôle de qualité pour éliminer les connecteurs et les séquences de faible qualité avant d'assembler la séquence génique. L'assemblage est le processus qui consiste à assembler une série de courtes séquences obtenues par séquençage en une séquence continue longue, c'est-à-dire qu'il s'agit du processus d'assemblage de courtes séquences en longues séquences de scaffolds.
- Pourquoi effectuer un assemblage de métagénome ?
- 1) Moins de temps de calcul pour effectuer des comparaisons de séquences après assemblage.
2) Le génome peut être reconstruit.
La longueur de lecture actuelle pour le séquençage de deuxième génération est plus courte.
- 1) Moins de temps de calcul pour effectuer des comparaisons de séquences après assemblage.
- Quels facteurs sont associés à l'efficacité de l'assemblage de métagénomes ?
- L'effet de l'assemblage de métagénomes est principalement lié à la quantité de données de séquençage des échantillons, à la diversité des espèces et à la répartition de l'abondance des espèces, ce qui peut rendre l'assemblage de métagénomes plus difficile que celui d'espèces uniques telles que les bactéries, et c'est le point sur lequel la recherche actuelle en métagénome doit progresser.
- Dans l'assemblage de métagénomes, pourquoi toutes les données d'échantillons ne peuvent-elles pas être combinées pour l'assemblage ?
- Les espèces à forte abondance dans différents échantillons sont très différentes ; si tous les échantillons sont mélangés pour l'assemblage, cela augmentera considérablement la complexité des données et l'effet d'assemblage pourrait être pire.
- Dans le processus d'assemblage, est-il vrai que les gènes communs à forte abondance peuvent être assemblés, mais que les gènes spécifiques à un individu à faible abondance ne peuvent pas être assemblés ?
- 1) En raison de l'influence de la profondeur de séquençage et du coût du séquençage, dans l'article actuel sur le métagénome, la quantité de données de séquençage est généralement choisie à 6G, ce qui peut détecter la plupart des microorganismes dans l'échantillon, mais pour certaines espèces à faible abondance, il est en effet probable qu'elles ne puissent pas être assemblées en raison de la profondeur de séquençage ;
2) Dans l'analyse de métagénomes, on se concentre généralement davantage sur la composition des espèces à forte abondance. Si vous souhaitez effectuer une analyse spéciale pour les espèces à faible abondance, vous devez généralement augmenter le volume de données de séquençage ou passer par un traitement spécial dans le processus de pré-extraction pour enrichir autant que possible les espèces à faible abondance, puis effectuer l'analyse de séquençage.
- 1) En raison de l'influence de la profondeur de séquençage et du coût du séquençage, dans l'article actuel sur le métagénome, la quantité de données de séquençage est généralement choisie à 6G, ce qui peut détecter la plupart des microorganismes dans l'échantillon, mais pour certaines espèces à faible abondance, il est en effet probable qu'elles ne puissent pas être assemblées en raison de la profondeur de séquençage ;
- Quelle est la quantité recommandée de séquençage pour différents échantillons ?
- Les volumes de séquençage varient généralement en fonction de la complexité de l'échantillon environnemental. Pour les types d'échantillons ayant une composition microbienne complexe, comme les échantillons de sol, un volume de séquençage de 12G est recommandé, tandis que pour les échantillons ayant une composition microbienne relativement simple, comme les échantillons intestinaux, un volume de séquençage de 6G est généralement recommandé.
- La séquençage du métagénome peut-il détecter des informations sur des microorganismes tels que les bactéries, les champignons, les protozoaires, le plancton et les virus ?
- Oui, car l'ADN extrait par séquençage métagénomique est l'ADN total des organismes dans l'échantillon environnemental, qui peut être séquencé et analysé pour détecter simultanément les informations sur les bactéries, les champignons, les protozoaires, le plancton et les virus (virus à ADN) dans l'environnement.
- Pour les projets de métagénomique, comment exclure la contamination par l'hôte ?
- 1) Lors de la prise d'échantillons, essayez de ne pas les prélever près du tissu.
2) Utilisez le kit approprié lors de l'extraction.
3) S'il existe un génome de référence, la contamination du génome hôte peut être éliminée par une analyse comparative.
- 1) Lors de la prise d'échantillons, essayez de ne pas les prélever près du tissu.
- La séquençage du métagénome peut-il être effectué s'il y a une grande quantité de contamination par l'hôte et qu'il n'y a pas de séquence de référence du génome de l'hôte ?
- Non, si l'ADN de l'hôte contient une grande quantité d'ADN environnemental, après séquençage, il y aura une contamination sérieuse, et il n'existe aucune séquence de génome d'hôte connue pour comparaison et décontamination, ce qui affectera la précision de l'analyse ultérieure et la quantité de données disponibles sera faible ; cependant, si la quantité de contamination du génome de l'hôte est faible pendant le processus d'extraction, la contamination peut être ignorée pour l'analyse des données ultérieures.
- Quels gènes sont annotés par KEGG ?
- Tous les gènes annotés par notre analyse peuvent être annotés, et vous pouvez également sélectionner les parties qui vous intéressent.
- Ai-je besoin d'avoir des réplicats biologiques pour une méta-analyse ?
- Il est préférable d'avoir 5 réplicats biologiques ou plus, et plus de 10 réplicats biologiques sont recommandés pour les échantillons humains et animaux en raison de leur spécificité individuelle.
Préparation des échantillons
- Quelles sont les considérations pour la préparation d'échantillons de sol en métagénomique ?
- Échantillons de sol : Lors de l'échantillonnage, retirez la couche de sol flottante en surface, creusez la couche de sol à 5-20 cm de profondeur à l'aide d'une pelle à feu à l'éthanol. Après avoir enlevé les racines visibles, le sol est passé au tamis de 2 mm. Chaque échantillon est prélevé à partir de 3 sites d'échantillonnage et mélangé, où le volume de l'échantillon est de 5 g. Conservez les échantillons de sol collectés dans des tubes de centrifugeuse stériles, placez-les en dessous de 0℃. Après la collecte des échantillons, transportez-les au laboratoire pour l'extraction de l'ADN et utilisez-les pour l'extraction de l'ADN. Si vous ne pouvez pas expérimenter immédiatement, veuillez congeler rapidement les échantillons de sol dans un réfrigérateur à -20℃.
- Quelles sont les considérations pour la préparation d'échantillons de fumier en métagénomique ?
- Échantillons de selles : Les selles peuvent être conservées à -80°C. En règle générale, il est préférable de prélever des selles internes pour l'extraction du génome, mais cela n'est pas facile à manipuler. En raison des particularités des selles elles-mêmes, il est recommandé de les collecter et de les stocker à tout moment pour obtenir une extraction optimale de l'ADN.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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