Détection de la 5-Méthylcytosine (5mC) de l'ADN par protocole de séquençage Nanopore

Extraction d'ADN génomique

Extraction de l'ADN génomique par phénol-chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol

1. Homogénéisez les embryons de poisson zèbre dans 200 μL de tampon d'homogénéisation et incubez l'échantillon à 55℃ pendant pas plus de 2 h. Inversez le tube plusieurs fois pour vous assurer que les embryons sont homogénéisés après l'incubation.
2. Pour éliminer la contamination par l'ARN, incubez l'échantillon à 95℃ pendant 10 minutes. Ajoutez 1 μL de RNase A par 100 μL d'ADN génomique homogénéisé et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.
3. Effectuez deux extractions phénol-chloroforme sur les échantillons. Ajoutez un mélange de phénol-chloroforme-alcool isoamyle à l'échantillon dans un rapport de 1:1 (environ 200 μL). Inversez le tube plusieurs fois pour mélanger les solutions. Faites tourner pendant 5 minutes à 13 000 tr/min (16 000 rcf).
4. Retirez environ 180 μL de la couche aqueuse supérieure des solutions mélangées et transférez-les dans un nouveau tube Eppendorf, en veillant à ne pas retirer de solution de la phase phénol-chloroforme-alcool isoamyle. Répétez l'extraction au phénol-chloroforme sur la couche aqueuse séparée.
5. Ajouter 1/10 de volume de l'acétate de sodium 3 M (pH 5,2), 2,5 volumes d'éthanol absolu glacé et 2 μL d'acrylamide linéaire à l'ADN génomique. Précipiter à -80℃ pendant 30 minutes à 1 heure ou à -20℃ pendant au moins 1 heure. Des périodes de précipitation prolongées (comme toute la nuit) peuvent augmenter le rendement.
6. Après précipitation, centrifugez les échantillons à pleine vitesse pendant 5 minutes. Retirez le surnageant et rincez le culot dans 500 μL d'éthanol à 70 % froid. Centrifugez les échantillons à pleine vitesse pendant 5 minutes. Retirez le surnageant.
7. Resuspendre le culot dans de l'eau sans nucléase ou dans un tampon d'élution à la volume désiré. Conserver à -20 ℃.

Contrôle de qualité

1. Utilisez un essai fluorométrique sensible selon les instructions du fabricant pour quantifier avec précision la quantité d'ADN génomique présente dans votre échantillon. Au moins 1 μg d'ADNg doit être présent dans votre échantillon. Utilisez le spectrophotomètre NanoDrop 2000 pour déterminer la pureté de l'échantillon d'ADNg. Les paramètres suivants doivent être respectés lors du séquençage d'un échantillon.
2. Exécutez l'ADNg sur un TapeStation en utilisant les réactifs d'analyse Genomic DNA ScreenTape pour déterminer la distribution de taille des fragments d'ADN. Si des fragments d'ADN de moins de 1 kb sont présents, passez à l'étape 3. Si les fragments d'ADN sont plus grands d'au moins 1 kb, passez à la préparation de la bibliothèque et au séquençage.
3. Les fragments d'ADN de moins de 1 kb peuvent être éliminés conformément aux instructions du fabricant. Ce protocole permet une déplétion presque complète des fragments de moins de 5 kb et une déplétion progressive des fragments de moins de 10 kb. L'efficacité de récupération est d'environ 50 à 90 % de l'ADN d'entrée. Pour garantir que l'échantillon respecte toutes les exigences de sélection par taille, répétez toutes les étapes de contrôle de qualité détaillées dans le Contrôle de Qualité après la sélection par taille.

Préparation de la bibliothèque et séquençage

La préparation de la bibliothèque et le séquençage sont effectués à l'aide du Kit de Séquençage par Ligation conformément aux instructions du fabricant. Alternativement, la préparation de la bibliothèque et le séquençage peuvent être réalisés dans un établissement qui propose des services de séquençage Nanopore.

Référence :

1. Angeloni A, Ferguson J, Bogdanovic O. Séquençage par nanopore et analyse des données pour le profilage du 5-méthylcytosine à résolution de base dans tout le génome[M]//Chromatine. Humana, New York, NY, 2022 : 75-94.