Aperçu de la recherche sur les exosomes

Les vésicules extracellulaires (VE), communément appelées exosomes, sont une caractéristique omniprésente dans le domaine de la biologie cellulaire. La recherche a fermement démontré que ces vésicules ne sont pas seulement sécrétées par des cellules eucaryotes, mais qu'elles sont également produites par toutes les cellules procaryotes, étendant ainsi leur prévalence. Au sein des organismes multicellulaires, les exosomes sont disséminés dans une gamme de fluides corporels, englobant le sang, l'urine, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique, l'ascite, le liquide céphalorachidien, la bile, le sperme, et plus encore.

Ces vésicules sont souvent désignées par différents noms dans la littérature scientifique, en fonction de leur origine, de leur nature et de leurs caractéristiques. Bien qu'il n'existe pas de définition universellement acceptée, il existe une catégorisation générale qui distingue les exosomes, les vésicules de déchirement, les microparticules et les microvésicules (MV), qui mesurent généralement entre 150 et 1000 nanomètres et se forment par bourgeonnement de la membrane cellulaire. En revanche, les exosomes sont un sous-type de vésicules extracellulaires (VE) caractérisé par leur structure de membrane en bicouche lipidique. Ils ont un diamètre d'environ 30 à 100 nanomètres et se forment de manière intracellulaire au sein de corps multivésiculaires (MVB) par la fusion de plusieurs endosomes avec la membrane cellulaire.

Composition des exosomes

Les exosomes comprennent une vaste gamme de composants. En 1981, Trams et ses collègues ont d'abord conceptualisé l'idée des exosomes lorsqu'ils ont découvert des vésicules sécrétées par des cellules présentant une activité enzymatique extracellulaire. Ce concept a ensuite été appliqué aux vésicules libérées lors de la différenciation des réticulocytes, qui ont généralement un diamètre allant d'environ 30 à 100 nanomètres. Au fil des années suivantes, il est devenu évident que divers types de cellules, y compris les lymphocytes B, les cellules dendritiques, les cellules T, les mastocytes, les cellules neuronales, les cellules endothéliales et les cellules épithéliales, peuvent sécréter des exosomes. De plus, plusieurs fluides corporels, tels que le sang, l'urine, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique, l'ascite, le liquide céphalorachidien, la bile et le sperme, contiennent également des exosomes.

Les exosomes partagent des composants protéiques communs impliqués dans le transport et la fusion des membranes, y compris des GTPases, des annexines, des flotillines, ainsi que des protéines transmembranaires comme CD9, CD63, CD81 et CD82. Des protéines de choc thermique (Hsc70 et Hsp90), des protéines de biogenèse des vésicules (Alix et TSG101), des protéines associées aux lipides et des phospholipases sont également présentes dans tous les types d'exosomes. Actuellement, plus de 4500 protéines différentes ont été identifiées dans les exosomes. En plus des protéines, les exosomes contiennent une variété de lipides tels que le cholestérol, les sphingolipides et les glycérophospholipides à chaîne longue.

De plus, les exosomes abritent une vaste gamme d'espèces d'ARN, comprenant ARN messager (ARNm), microARN (miARN)et divers ARN non codants, notamment l'ARN nucléaire small (snRNA), l'ARN nucléolaire small (snoRNA), l'ARN spécifique des corps de Cajal small (scaRNA), l'ARN interagissant avec piwi (piRNA), ARN long non-codant (lncRNA)et ARN circulaire (circARN)La majorité de ces molécules d'ARN identifiées dans les EVs présentent des longueurs allant de 20 à 200 nucléotides. Ce spectre inclut des miARN de longueur complète et des tARN, ainsi que des formes fragmentées d'ARNm et d'ARNr.

Quelles sont les fonctions des exosomes ?

Les exosomes, initialement perçus comme des débris cellulaires lors de leur découverte, ont suscité un intérêt croissant ces dernières années en raison de leur rôle essentiel dans la communication intercellulaire. Ces minuscules vésicules membranaires sont désormais reconnues pour leur contenu en protéines, lipides et acides nucléiques spécifiques aux cellules, qui agissent comme des molécules de signalisation lorsqu'elles sont transmises aux cellules réceptrices, influençant ainsi leurs fonctions cellulaires. Les exosomes jouent des rôles cruciaux dans une large gamme de processus physiologiques et pathologiques, y compris la présentation d'antigènes du système immunitaire, la croissance tumorale et la métastase, la régénération des tissus après une blessure, l'apoptose cellulaire programmée, la régénération vasculaire, l'inflammation, la coagulation sanguine, la propagation des pathogènes, et plus encore. Différents types de cellules sécrètent des exosomes avec des compositions et des fonctions distinctes, les rendant précieux en tant que biomarqueurs pour le diagnostic des maladies. En raison de leur structure de membrane en double couche lipidique, les exosomes offrent une protection efficace pour leur cargaison et peuvent être ciblés sélectivement vers des cellules ou des tissus spécifiques, ce qui en fait une plateforme prometteuse pour la délivrance de médicaments.

Au milieu de l'accent croissant mis sur la médecine de précision, il y a une attention grandissante portée à l'obtention de diagnostics précis des maladies et de traitements sur mesure. Les exosomes, un domaine d'investigation émergent et novateur, présentent une avenue prometteuse dans cette quête. Leur ubiquité dans le corps et la facilité de leur récupération les positionnent comme une approche potentiellement efficace pour le diagnostic et le traitement des maladies. Cela souligne leur potentiel significatif dans l'avancement du domaine de la médecine de précision.

Isolation des vésicules extracellulaires

Ultracentrifugation

L'ultracentrifugation est une méthode courante pour l'isolement des exosomes et peut être utilisée en association avec la centrifugation sur gradient de saccharose ou la séparation par coussin de saccharose pour les exosomes de faible abondance. Bien que cette méthode soit simple à mettre en œuvre, elle présente des limitations, telles que la capacité à traiter uniquement jusqu'à six échantillons simultanément en raison des contraintes du rotor, et le rendement peut être incohérent, ce qui peut être lié au type de rotor utilisé. L'ultracentrifugation nécessite également une quantité substantielle de matériel de départ, et le rendement et la pureté des exosomes obtenus peuvent être discutables. De plus, des étapes de centrifugation répétées peuvent potentiellement endommager les vésicules, entraînant une réduction de leur qualité. Cependant, lorsque l'ultracentrifugation est combinée avec la centrifugation sur gradient de saccharose, elle peut produire des exosomes de haute pureté, bien que cette approche soit relativement chronophage.

Immunoaffinité par billes magnétiques

Les exosomes possèdent des marqueurs de surface spécifiques tels que les protéines CD63 et CD9. En incubant les exosomes avec des billes magnétiques recouvertes d'anticorps contre ces marqueurs, les exosomes peuvent être capturés et isolés. L'immunoaffinité par billes magnétiques présente des avantages, notamment une haute spécificité, une facilité d'opération et un impact minimal sur l'intégrité de la morphologie des exosomes. Cependant, elle présente des inconvénients, notamment une efficacité inférieure, la susceptibilité de l'activité biologique des exosomes aux variations de pH et de concentration en sel, ce qui peut entraver les expériences en aval, et une applicabilité limitée à grande échelle.

Méthode de précipitation à base de PEG

Le polyéthylène glycol (PEG) peut être utilisé pour co-précipiter des protéines hydrophobes et des molécules lipidiques. Initialement utilisé pour la collecte de virus à partir d'échantillons comme le sérum, il est désormais également utilisé pour la précipitation d'exosomes. Le principe derrière cette technique pourrait impliquer une liaison compétitive avec des molécules d'eau libres.

Cependant, l'utilisation de PEG pour la précipitation des exosomes présente plusieurs défis. Ceux-ci incluent des problèmes de pureté et de rendement, une présence élevée d'impuretés (menant à des faux positifs), des tailles de particules non uniformes, la formation d'agrégats inextricables difficiles à éliminer, et la perturbation potentielle des exosomes par des forces mécaniques ou des additifs chimiques tels que le Tween-20. Par conséquent, les études utilisant la précipitation par PEG pour l'isolement des exosomes peuvent faire l'objet d'un examen minutieux lors de leur publication.

Extraction par réactif

Ces dernières années, divers kits de réactifs pour l'extraction d'exosomes ont émergé sur le marché. Certains de ces kits utilisent des filtres spécialement conçus pour éliminer les impuretés, tandis que d'autres emploient la chromatographie par exclusion de taille (SEC) pour la séparation et la purification. Il existe également des kits qui s'appuient sur des méthodes de précipitation de composés pour précipiter les exosomes. Ces kits de réactifs ne nécessitent pas d'équipement spécialisé, et alors qu'ils subissent des mises à jour et des améliorations continues, leur efficacité d'extraction et d'épuration augmente progressivement. Par conséquent, ils remplacent progressivement les méthodes d'ultracentrifugation et gagnent en adoption.

Identification des exosomes isolés

Identification par microscopie électronique

L'approche la plus simple pour identifier les exosomes consiste à les observer au microscope électronique. Lors d'un examen typique des exosomes par microscopie électronique, ces vésicules apparaissent comme des structures sphériques ou en forme de coupe, présentant des tailles comprises entre 30 et 100 nanomètres.

Identification par Western Blot

Après l'isolement des exosomes, une analyse par Western blot (WB) peut être réalisée avec des protéines spécifiques associées aux exosomes. Le WB inclut généralement des protéines liées à la synthèse des corps multivésiculaires (MVB), telles qu'Alix et TSG101, ainsi que des protéines transmembranaires tetraspanines (CD9, CD63, CD81, CD82). Il est également conseillé d'inclure des marqueurs non-exosomes dans le WB, tels que GRP94, EEA1, Cytochrome c, GM130, PMP70, Calréticuline, prohibitine, qui sont absents dans les exosomes et sont exclusifs aux protéines cellulaires totales.

Comment extraire ARN des exosomes

Une fois que les vésicules extracellulaires (EV) ont été isolées, l'ARN peut être extrait directement en utilisant les méthodes suivantes :

Isoler les EVs à l'aide d'un kit commercial, puis extraire l'ARN à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN.

Isoler les EVs en utilisant un kit commercial, puis utiliser un kit d'extraction d'ARN correspondant conçu pour les EVs.

Nos expériences comparatives ont montré que la stratégie 1 donne des résultats d'extraction supérieurs.

Application de recherche sur les exosomes

L'imagerie in vivo confirme la livraison généralisée d'exosomes.

Le 21 mai 2015, une découverte révolutionnaire dans le domaine de la recherche sur la métastase du cancer a été publiée dans le prestigieux journal "Cell". L'étude a été réalisée par une équipe de chercheurs de l'Institut Hubrecht. Leur recherche a confirmé que les cellules cancéreuses en cours de métastase peuvent transmettre des comportements spécifiques à des cellules cancéreuses moins malignes. Cette découverte significative offre des perspectives précieuses sur le comportement du cancer et promet d'améliorer le diagnostic et le traitement du cancer.

Le cancer résulte de l'accumulation d'erreurs génétiques dans l'ADN des cellules. Certaines de ces erreurs amènent les cellules à ignorer les signaux qui contrôlent la croissance et la différenciation, entraînant une division cellulaire incontrôlée. Cela conduit finalement à la croissance de tumeurs, les cellules tumorales accumulant de plus en plus d'erreurs. En raison du fait que chacune de ces erreurs d'ADN dans les cellules tumorales individuelles est unique (hétérogénéité tumorale), le comportement de ces cellules tumorales individuelles peut également différer. Cette complexité rend le cancer difficile à traiter, car des combinaisons spécifiques d'erreurs d'ADN peuvent rendre certaines cellules tumorales résistantes au traitement.

Pour mieux comprendre le comportement des cellules tumorales individuelles, les chercheurs ont développé des techniques de microscopie spécialisées, y compris la microscopie in vivo, pour capturer les actions des cellules cancéreuses au sein d'organismes vivants. Ils ont attribué différentes couleurs aux cellules tumorales portant des erreurs d'ADN distinctes en utilisant des marqueurs fluorescents. En imagerie de ces cellules colorées, il est devenu évident quelles cellules étaient mobiles et capables d'initier des métastases dans le corps.

Des cellules cancéreuses malignes invasives (bleues) libèrent de très petites vésicules extracellulaires (EV), telles que des exosomes et des microvésicules, contenant des molécules capables d'induire la malignité cellulaire. Des cellules moins malignes (rouges) absorbent ces EV, modifiant leur comportement. Les cellules moins malignes deviennent plus malignes et initient la métastase (verte).

Les scientifiques ont également confirmé que ces EVs périlleux peuvent circuler dans le sang vers d'autres sites tumoraux, reproduisant un comportement malin sur de longues distances.

Les exosomes déterminent la spécificité organique de la métastase tumorale.

Le principal contributeur aux décès liés au cancer est la dissémination des cellules cancéreuses de leur site primaire vers des organes distants via le système circulatoire. Ce processus métastatique n'est pas stochastique par nature. Au contraire, des sous-ensembles spécifiques de cellules cancéreuses suivent des voies moléculaires complexes qui leur permettent de cibler sélectivement des organes particuliers et d'y établir des colonies. Cette migration dirigée implique une interaction dynamique entre les cellules cancéreuses, souvent appelées de manière informelle les "graines", et le microenvironnement au sein de l'organe de destination, communément appelé le "sol".

Des enquêtes scientifiques récentes ont révélé un phénomène intrigant suggérant que, avant l'arrivée des "graines" métastatiques, elles ont le potentiel de moduler le microenvironnement, souvent appelé "sol", par l'utilisation de vésicules extracellulaires, en particulier des exosomes. Les exosomes sont succinctement caractérisés comme de minuscules vésicules extracellulaires capables de transporter une variété de molécules, englobant des protéines, des lipides et des acides nucléiques, entre les cellules. Ces vésicules possèdent la capacité unique de naviguer dans le système circulatoire, leur permettant d'atteindre des sites anatomiques distants. Cette interaction complexe orchestre un dialogue moléculaire, préparant finalement le terrain pour la métastase tumorale à venir.

Lorsque des exosomes dérivés de cellules cancéreuses sont injectés dans des souris, ces exosomes ont tendance à s'accumuler dans les organes où les cellules cancéreuses sont susceptibles de métastaser. De plus, ces exosomes spécifiques à un organe peuvent interagir avec différents types de cellules. Par exemple, les exosomes ciblant les poumons adhèrent aux cellules endothéliales dans les poumons, tandis que ceux ciblant le foie pénètrent dans les cellules immunitaires de Kupffer. L'injection d'exosomes dérivés de cellules cancéreuses dans la même lignée cellulaire confirme que les exosomes facilitent la métastase tumorale spécifique à un organe.

Les chercheurs ont également fait une découverte intrigante : les exosomes provenant de cellules de cancer du sein qui se métastasent généralement vers les poumons peuvent rediriger un autre type de cellule tumorale, qui migre habituellement vers les os, pour se métastaser vers les poumons. Cette découverte souligne davantage que les caractéristiques de la métastase des cellules tumorales ne sont pas autonomes, mais sont influencées par des facteurs externes.

Les chercheurs ont fourni plusieurs indices sur la manière dont les exosomes influencent la métastase spécifique aux organes. Ils ont découvert que les exosomes ciblant différents organes possèdent des protéines réceptrices d'adhésion cellulaire distinctes, en particulier des intégrines à leur surface. Différents types d'exosomes montrent une préférence pour pénétrer dans des organes qui ont un nombre substantiel de ligands correspondant à leurs intégrines de surface. Par exemple, l'intégrine αVβ5 dirige les exosomes vers le foie, tandis que l'intégrine α6β4 les dirige vers les poumons. De plus, inhiber l'expression des exosomes ou des intégrines peut inhiber la métastase du cancer. Enfin, lorsque les exosomes envahissent l'organe cible, ils déclenchent la synthèse des protéines S100, favorisant l'inflammation et la migration cellulaire, et activent les protéines Src, qui posent toutes les bases de la métastase des cellules cancéreuses.

Présence de l'ARN circulaire dans les exosomes

ARN circulaire (circARN) est une molécule d'ARN omniprésente et exceptionnellement stable, ayant une importance réglementaire substantielle dans l'expression génique des mammifères. Parallèlement, les exosomes, de minuscules vésicules membranaires dérivées de processus endocytotiques, ont émergé comme un sujet de recherche considérable. Dans une enquête révolutionnaire récemment menée par l'équipe de recherche dirigée par Shenglin Huang et Xianghuo He à l'Institut d'oncologie de l'Université Fudan, une révélation intrigante a été mise en lumière. Cette étude a dévoilé une richesse de circARN au sein des exosomes, un phénomène auparavant non reconnu. Les résultats notables de cette recherche ont été publiés dans la revue Cell Research.

L'équipe de recherche a extrait ARN total (excluant l'ARN ribosomique) à la fois des cellules cancéreuses du foie MHCC-LM3 et des exosomes dérivés de ces cellules. Ils ont mené Analyse de l'ARN-seq et ont constaté que les circARN dans les exosomes sont beaucoup plus abondants que ceux dans les cellules sources.

A : Le diagramme Circos affiche les circRNA dans les cellules et les exosomes dérivés des cellules ; D : Le ratio de circRNA par rapport à l'ARN linéaire est six fois plus élevé dans les exosomes que dans les cellules. E : Après la transfection des cellules HEK293T avec des mimétiques de miR-7, les niveaux de CDR1as dans les cellules et les exosomes dérivés des cellules ont été évalués.

Les chercheurs désignent l'circRNA présent dans les exosomes comme exo-circRNA. L'exo-circRNA est plus de deux fois plus abondant que le circRNA trouvé dans les cellules sources. De plus, le circRNA entrant dans les exosomes dépasse la quantité d'ARN linéaire.

Des recherches antérieures ont déjà démontré la capacité des ARN circulaires (circARN) à interagir avec les miARN. Étant donné l'abondance des miARN dans les exosomes, les chercheurs ont approfondi la relation complexe entre les circARN et les miARN. Plus précisément, ils se sont concentrés sur CDR1as, reconnu comme une éponge pour miR-7. Pour explorer cette relation, des mimétiques de miR-7 ont été transfectés dans des cellules HEK293T, et les niveaux de CDR1as ont été évalués à la fois dans les cellules et dans leurs exosomes. Notamment, l'étude a révélé une réduction substantielle des niveaux de CDR1as dans les exosomes après la transfection de miR-7, tandis que la diminution dans les cellules était marginale. Cette découverte implique que l'emballage des circARN dans les exosomes est un processus régulé, influencé, du moins en partie, par la modulation des niveaux de miARN pertinents dans les cellules sources.

En plus des exosomes dérivés des cellules, les chercheurs ont également découvert une quantité significative de circRNA intact et stable dans les exosomes du sérum humain. De plus, le circRNA dans les exosomes du sérum des patients atteints de cancer colorectal présentait des différences notables par rapport à ceux des individus en bonne santé. Le exo-circRNA provenant des tumeurs présente un potentiel prometteur en tant que biomarqueur pour la détection du cancer.

Séquençage du transcriptome des exosomes

Les exosomes contiennent principalement de l'ARN, y compris de l'ARN non codant.petit ARN, lncARN non codant, circARN) et ARN codant (ARNm). Ils jouent un rôle crucial dans la communication intercellulaire et la régulation de l'expression génique. Étant donné leurs avantages, tels que l'amplifiabilité et la haute représentation, l'ARN dans les exosomes occupe une position dominante dans la recherche sur le contenu des exosomes et l'exploration fonctionnelle. De plus, les petits ARN se composent de divers types de petits ARNy compris miARN, piARN, tsARN, YARN, chacun ayant des fonctions distinctes.

Les distinctions sont évidentes entre ARN exosomal et l'ARN extrait d'échantillons de tissu standard, incitant à des investigations sur la composition de l'ARN exosomal. CD Genomics a été à l'avant-garde d'un flux de travail complet basé sur des échantillons authentiques, englobant l'isolement des exosomes, l'extraction de l'ARN exosomal, la construction de bibliothèques de transcriptomes, l'établissement de bibliothèques de miARN et l'analyse subséquente des données acquises.

Références :

1. L'imagerie in vivo révèle un phénotypage médié par des vésicules extracellulaires du comportement métastatique. Cellule. 2015.
2. Cancer : Vésicules cherchant des organes. Nature. 2015.
3. L'ARN circulaire est enrichi et stable dans les exosomes : un biomarqueur prometteur pour le diagnostic du cancer. Rés. Cell.. 2015.