Intégration de WGBS avec RNA/ChIP-seq : Cas du développement des plantes et de la dynamique de liaison de Cdx2

Séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS) la technologie, avec sa capacité unique de détection à résolution monocouche, peut capturer avec précision Modification de la méthylation de l'ADN sites dans l'ensemble du génome, fournissant des données de haute résolution et de haute précision pour l'analyse des mécanismes de régulation épigénétique. Séquençage de l'ARN (RNA-seq) La technologie peut réaliser une analyse systématique et une caractérisation quantitative des profils d'expression génique au niveau du transcriptome grâce à sa quantité Qualcomm et à sa haute sensibilité.

La stratégie d'analyse conjointe de WGBS et de RNA-seq, en intégrant les informations sur les modifications épigénétiques et les données d'expression transcriptionnelle, construit un réseau d'association régulatoire à plusieurs niveaux de "méthylation de l'ADN-expression génique", qui offre une perspective de recherche multidimensionnelle et systématique pour analyser le mécanisme régulateur des biomolécules. Ce schéma d'intégration technologique est devenu un outil important dans la recherche de pointe en sciences de la vie et a montré une valeur d'application remarquable et un potentiel de recherche dans les domaines de l'analyse de l'hétérogénéité tumorale et de la recherche sur les mécanismes de réponse au stress des plantes.

Dans cet article, la WGBS combinée à l'ARN-seq et ChIP-seq Dans la révélation du mécanisme de régulation épigénétique, deux cas ont été exposés : la régulation par AtSAMS du développement des organes floraux d'Arabidopsis thaliana et la combinaison dynamique de Cdx2 dans le développement et l'état d'équilibre.

Révéler le mécanisme épigénétique de l'AtSAMS régulant les plantes

Titre : AtSAMS régule le développement des organes floraux par la méthylation de l'ADN et la voie de signalisation de l'éthylène

Magazine Publier : Science des Plantes

Facteurs d'impact : 4,2

Date de publication : 2023.07.03

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L'organe floral est la structure clé de la reproduction des plantes, et son développement est strictement contrôlé par l'hérédité. Le modèle ABC est une théorie classique pour expliquer le développement des organes floraux, dans laquelle les gènes fonctionnels A, B, C et E régulent respectivement la formation des sépales, des pétales, des étamines et des pistils. Cependant, le mécanisme de régulation de l'expression de ces gènes n'est pas complètement clair. En tant que modification épigénétique importante, la méthylation de l'ADN joue un rôle clé dans la régulation des gènes, la stabilité du génome et le développement des plantes. La S-adénosylméthionine synthase (SAMS) est une enzyme clé impliquée dans la biosynthèse de la S-adénosylméthionine, un donneur de méthyle universel dans la réaction de méthylation, et un précurseur commun de l'éthylène, des polyamines et d'autres biosynthèses. L'éthylène est une hormone végétale importante, qui participe à de nombreux processus physiologiques des plantes, y compris le développement des organes floraux. Cependant, il n'est pas clair comment la SAMS régule le développement des organes floraux par le biais de la méthylation et des voies de signalisation de l'éthylène.

Modèle de travail proposé pour la régulation des organes floraux par AtSAMS chez Arabidopsis (Hu et al., 2023)

Les résultats de l'analyse de cette étude ont révélé que le développement anormal des organes floraux chez les plantes avec surexpression d'AtSAMS dans Arabidopsis thaliana était causé par la déméthylation de l'ADN et la voie de signalisation de l'éthylène. Dans SAMOE (plante à surexpression d'AtSAMS), le niveau de méthylation de l'ADN du génome entier a diminué et le contenu en éthylène a augmenté. De plus, le niveau de transcription du gène ACE est fortement corrélé avec son niveau de méthylation, mais la régulation à la baisse du gène b peut ne pas être liée à la déméthylation mais être causée par la voie de signalisation de l'éthylène indépendamment de la méthylation médiée par SAMS. La méthylation médiée par SAMS et la voie de signalisation de l'éthylène peuvent interagir dans le développement des organes floraux.

La surexpression d'AtSAMS entraîne des organes floraux anormaux.

Les plantes SAMOE présentent une variété d'anomalies des organes floraux, y compris la transformation des sépales en pistils, la diminution des pétales et des étamines, etc., qui sont similaires aux phénotypes des mutants des gènes ABCE ou des souches surexprimées.

• Le niveau de transcription d'AtSAMS dans la plante surexprimée (SAMOE) a été détecté. L'actine a été utilisée comme référence interne, et le niveau standardisé du type sauvage (WT) a été fixé à 1. Les résultats ont montré que les niveaux d'expression d'AtSAMS dans S1OE-10, S1OE-21, S2OE-5 et S2OE-6 étaient significativement plus élevés que ceux du WT, indiquant que la surexpression était réussie.
• La proportion d'organes floraux anormaux dans WT, S1OE et S2OE a été comptée. Plus de 40 % des fleurs dans SAMOE se sont développées de manière anormale, tandis que la proportion dans WT était extrêmement faible, indiquant que la surexpression d'AtSAMS a conduit à des organes floraux anormaux.
• Montrez le phénotype anormal des organes floraux de SAMOE. La fleur WT a 4 sépales, 4 pétales, 6 étamines et 1 carpelle. Les fleurs SAMOE présentent de nombreuses anomalies, telles que des fleurs secondaires, des sépales transformés en carpelles, un nombre accru de carpelles, une diminution des étamines des sépales, des carpelles non complètement fusionnés, des sépales ressemblant à des feuilles, des étamines transformées en carpelles, et des pétales diminués ou augmentés.
• L'expression du gène ABCE dans WT et SAMOE a été analysée par qRT-PCR. Les résultats ont montré que les gènes de classe A (AP1, AP2) et les gènes de classe B (AP3, PI) étaient régulés à la baisse dans SAMOE, tandis que les gènes de classe C (AG) et les gènes de classe E (SEP1, SEP2, SEP3) étaient régulés à la hausse, ce qui correspondait au modèle d'expression génique dans le modèle ABCE.
• Comparez le contenu de S-adénosylméthionine (SAM) dans WT et SAMOE. Le contenu de SAM dans SAMOE était supérieur de 14,46 % (S1OE) et de 13,38 % (S2OE) à celui de WT, ce qui indique que la surexpression de AtSAMS a augmenté la synthèse de SAM.

L'overexpression d'AtSAMS présente des phénotypes anormaux des organes floraux chez Arabidopsis (Hu et al., 2023)

Une faible méthylation conduit à des organes floraux anormaux.

Les résultats de la WGBS ont montré que le niveau de méthylation de l'ADN du génome entier des plantes SAMOE a diminué de manière significative, en particulier dans l'environnement des séquences CHG et CHH, ce qui a conduit à des organes floraux anormaux.

• Comparez les taux de méthylation moyens des séquences CG, CHG et CHH dans WT et SAMOE. Les taux de méthylation des CG, CHG et CHH dans WT sont respectivement de 38,82 %, 20,03 % et 6,78 %. Les taux de méthylation de SAMOE dans ces trois environnements de séquence ont tous diminué de manière significative, avec S1OE diminuant de 24,17 %, 61,16 % et 29,06 %, et S2OE diminuant de 18,80 %, 51,28 % et 29,79 %, respectivement, indiquant qu'il y avait une hypométhylation à l'échelle du génome dans SAMOE.
• Le niveau d'expression des gènes impliqués dans la méthylation de l'ADN dans SAMOE (SAMOE vs WT) a été analysé. Les résultats ont montré que plusieurs gènes codant pour des méthyltransférases dépendantes de SAM (comme AT1G24480 et AT1G67990) étaient régulés à la baisse, tandis que le gène inhibiteur de méthyltransférase SAH7 était régulé à la hausse. En même temps, l'expression des gènes DRM2, NRPD1, DCL1/2/3, RDR1/2, AGO6 et d'autres gènes dans la voie RdDM a diminué, tandis que l'expression des gènes déméthylases de l'ADN (ROS1, DME) a augmenté, indiquant que l'hypométhylation de l'ADN dans SAMOE pourrait être causée par la diminution de l'expression des méthyltransférases dépendantes de SAM et des gènes liés à la voie RdDM, ainsi que par l'augmentation de l'expression des déméthylases de l'ADN.

Le taux de méthylation et le niveau d'expression des gènes impliqués dans la méthylation de l'ADN de SAMOE (Hu et al., 2023)

Les niveaux de méthylation des gènes C et E ont changé.

Les résultats de WGBS et de McrBC-qPCR ont montré que les variations des niveaux de méthylation des gènes fonctionnels A, C et E étaient significativement liées à leurs niveaux d'expression, tandis que les variations d'expression des gènes fonctionnels B n'avaient rien à voir avec la méthylation.

• Le phénotype des organes floraux chez les plantes WT traitées avec un inhibiteur de méthylation de l'ADN à 20 mM, le 5'-Aza. Comparées au contrôle (faux traitement), les plantes traitées avec le 5'-Aza ont montré un nanisme, des feuilles tordues, un nombre accru de feuilles en rosette, des tiges groupées et d'autres phénotypes, et les organes floraux ont également montré des anomalies similaires à celles de SAMOE, telles qu'un nombre réduit de pétales, de sépales et d'étamines, 6 pétales, des carpelles non fusionnés et des fleurs secondaires, ce qui indique que la déméthylation de l'ADN pourrait entraîner des organes floraux anormaux.
• Le niveau de méthylation de la région du promoteur du gène ABCE après traitement par 5'-Aza a été analysé par McrBC-qPCR. Les résultats ont montré que les gènes de classe A (AP1, AP2) étaient hyperméthylés, les gènes de classe C (AG) et les gènes de classe E (SEP1, SEP2, SEP3) étaient hypométhylés, ce qui était cohérent avec les résultats de WGBS.
• La qRT-PCR a été utilisée pour analyser l'expression du gène ABCE dans des inflorescences traitées avec un témoin et 5'-Aza. Les résultats ont montré que les gènes de classe A et de classe B étaient régulés à la baisse, tandis que les gènes de classe C et de classe E étaient régulés à la hausse, ce qui était cohérent avec le modèle d'expression dans SAMOE, indiquant en outre que la déméthylation de l'ADN a conduit à des organes floraux anormaux en modifiant l'expression du gène ABCE.

Effets de la méthylation de l'ADN sur les organes floraux d'Arabidopsis (Hu et al., 2023)

Changements dans le niveau d'expression du gène ABCE chez les plantes SAMOE

Les résultats de l'ARN-seq et du qRT-PCR ont montré que les expressions des gènes fonctionnels A (AP1 et AP2) et B (AP3 et PI) étaient régulées à la baisse, tandis que les expressions des gènes fonctionnels C (AG) et E (SEP1, SEP2 et SEP3) étaient régulées à la hausse.

• Le niveau de méthylation du gène ABCE dans WT et SAMOE a été comparé à l'aide des données WGBS-seq. Les résultats ont montré que les gènes de classe A (AP1, AP2) étaient hyperméthylés, les gènes de classe C (AG) et les gènes de classe E (SEP1, SEP3) étaient hypométhylés dans SAMOE, tandis que le niveau de méthylation des gènes de classe B (AP3, PI) est resté inchangé.
• La qPCR McrBC a été utilisée pour analyser le niveau de méthylation de la région promotrice du gène ABCE chez WT et SAMOE. Les résultats sont cohérents avec le séquençage WGBS, avec AP1 et AP2 hyperméthylés, AG, SEP1 et SEP3 hypométhylés.
• Thermogram des gènes exprimés différemment (DEGs) dans WT et SAMOE. Les résultats ont montré que le niveau d'expression de la plupart des gènes dans SAMOE était inférieur à celui de WT, parmi lesquels il y avait 2027 gènes (régulés à la baisse de 72,2 %) dans S1OE et 1040 gènes (régulés à la baisse de 67 %) dans S2OE, indiquant qu'il y avait une régulation globale à la baisse de l'expression génique dans SAMOE.
• Analyse le niveau d'expression du gène ABCE dans SAMOE. AP1, AP2, AP3 et PI étaient régulés à la baisse, tandis qu'AG, SEP1, SEP2 et SEP3 étaient régulés à la hausse, ce qui était cohérent avec les résultats de qRT-PCR, indiquant que les changements d'expression du gène ABCE étaient liés au niveau de méthylation (gène ACE) ou non (gène B).

Le niveau de méthylation et d'expression des gènes ABCE dans SAMOE (Hu et al., 2023)

WGBS combiné avec ChIP-seq révèle le mécanisme de liaison dynamique de Cdx2

Titre : La distribution des motifs et la méthylation de l'ADN sous-tendent un lien distinct de Cdx2 durant le développement et l'homéostasie.

Magazine publié : Nature Communications

Facteurs d'impact : 16,6

Date de publication : 22 janvier 2025.

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Cdx2 est un facteur de transcription clé et joue un rôle décisif dans le développement des cellules épithéliales intestinales chez les souris. Il est exprimé à la fois dans les cellules épithéliales intestinales embryonnaires et adultes, mais ses sites de liaison génomiques diffèrent entre le développement et l'âge adulte. La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique, généralement associée au silençage des gènes. Cependant, certains facteurs de transcription (comme Cdx2) peuvent être plus enclins à se lier à des séquences d'ADN méthylées. Les facteurs de transcription guident le développement des tissus en combinant des cibles spécifiques à un stade de développement et en établissant un paysage d'activateurs approprié. La séquence d'ADN et la modification de la chromatine guideront la liaison génomique des facteurs de transcription. Cependant, peu de choses sont connues sur la façon dont les facteurs de transcription naviguent dans les caractéristiques de la chromatine pour se lier sélectivement à un petit sous-ensemble de tous les sites cibles génomiques possibles.

Les résultats de cette étude révèlent que Cdx2, en tant que facteur de transcription déterminant la lignée, qui se lie à différentes cibles dans les cellules épithéliales intestinales en développement et les cellules épithéliales intestinales adultes, a une affinité préférentielle pour un motif atypique contenant des CpG in vivo. La haute fréquence des motifs dans les cibles embryonnaires de Cdx2 et l'état de méthylation des CpG pendant le développement permettent à Cdx2 de se lier sélectivement et d'activer des amplificateurs et des gènes de développement.

Changements dynamiques des sites de liaison de Cdx2

Il existe des différences significatives dans les sites de liaison de Cdx2 entre les cellules épithéliales intestinales embryonnaires (E12.5 et E16.5) et adultes de souris. À l'étape embryonnaire, les sites de liaison étaient principalement répartis dans la région du promoteur (24 %), tandis qu'à l'étape adulte, les sites de liaison étaient principalement répartis dans la région de l'activateur (> 87 %). Ce changement de mode de liaison du promoteur à l'activateur reflète les changements fonctionnels de Cdx2 à différents stades de développement. Cdx2 active des gènes de développement clés (comme Sox4 et Meis1) en se liant aux régions promoteurs à l'étape embryonnaire et maintient la fonction à l'état d'équilibre des tissus (comme Krt19 et Fabp2) en se liant aux régions d'activateur à l'étape adulte.

L'évolution de la liaison de Cdx2 à travers les promoteurs et les enhancers géniques soutient les fonctions développementales et homéostatiques dans l'épithélium intestinal (Lorzadeh et al., 2025)

Préférence du motif de liaison Cdx2

Cdx2 a tendance à se lier à des motifs atypiques (ATAAA+CpG) contenant des CpG au stade embryonnaire, tandis qu'il a tendance à se lier à des motifs classiques sans CpG au stade adulte. Cette préférence pour les motifs permet à Cdx2 de se lier sélectivement à différents sites génomiques à différents stades de développement. Le CpG lié par Cdx2 contient un motif, qui est généralement méthylé au stade embryonnaire, favorisant ainsi la liaison de Cdx2 et l'activation des gènes. À l'âge adulte, la déméthylation de ces sites empêche la liaison de Cdx2, évitant ainsi une liaison ectopique.

Présence accrue du motif Cdx2 contenant des CpG à ses sites de liaison développementaux (Lorzadeh et al., 2025)

Effet synergique de la liaison de Cdx2 et de la modification de la chromatine

Cdx2 peut recruter Ctcf et Hnf4a à différents sites génomiques en combinant différents motifs. Au stade embryonnaire, Cdx2 recrute Ctcf en combinant le motif CpG pour former des super-enhancers, qui activent les gènes liés au développement. À l'âge adulte, Cdx2 recrute Hnf4a en combinant des motifs classiques pour former des enhancers homéostatiques, qui maintiennent la fonction tissulaire. Le site de liaison de Cdx2 présente généralement une haute accessibilité de la chromatine au stade embryonnaire, mais au stade adulte, il est nécessaire de réguler l'état de la chromatine par le biais de la déméthylation et d'autres mécanismes, afin de réaliser la régulation de l'expression génique.

cdx2 facilite l'établissement de super-enhancers homéostatiques adultes en dirigeant le recrutement de Ctcf (Lorzadeh et al., 2025)

Effet de la méthylation de l'ADN sur la liaison de Cdx2

À travers le changement de la méthylation de l'ADN induit par l'invalidation du gène Eed ou l'inhibiteur GSK-3484862, il a été constaté que ce changement peut ré-recruter Cdx2 sur le site cible du stade de développement, activant ainsi l'expression génique à ce stade. À l'âge adulte, en induisant la méthylation de l'ADN, Cdx2 peut se recombiner sur le site cible du développement, ce qui indique que la liaison de Cdx2 est régulée par la méthylation de l'ADN. Cette liaison dépendante de la méthylation permet à Cdx2 de réguler l'expression génique en se liant à différents sites génomiques à différents stades de développement et dans des conditions d'état stationnaire.

La perte d'activité de PRC2 entraîne un gain de méthylation de l'ADN au niveau des enhancers, ce qui conduit au recrutement de Cdx2 (Lorzadeh et al., 2025).

Conclusion

La combinaison de WGBS avec ChIP-seq et RNA-seq peut analyser le réseau de régulation de l'expression génique sous plusieurs dimensions. WGBS peut révéler des motifs de méthylation de l'ADN, ChIP-seq peut localiser des sites d'interaction protéine-ADN tels que la modification des histones, et RNA-seq montre la dynamique du transcriptome. Grâce à l'application combinée, la relation entre la modification épigénétique, l'état de la chromatine et l'expression génique peut être établie, et le mécanisme de la régulation épigénétique peut être expliqué plus en détail. Cette technologie combinée a émergé dans la recherche sur le développement, les maladies, etc. À l'avenir, l'intégration avec la technologie des cellules uniques favorisera le développement de la recherche sur la régulation apparente vers une résolution plus élevée et une direction plus dynamique, et ouvrira une nouvelle voie pour la recherche en sciences de la vie.

Références :

1. Hu W, Hu S, Li S, et al. "AtSAMS régule le développement des organes floraux par la méthylation de l'ADN et la voie de signalisation de l'éthylène." Sciences des plantes. 2023 334 : 111767 Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à des contenus spécifiques en ligne. Si vous avez un texte que vous souhaitez traduire, veuillez le copier ici et je me ferai un plaisir de le traduire pour vous.
2. Lorzadeh A, Ye G, Sharma S, Jadhav U. "La distribution des motifs et la méthylation de l'ADN sous-tendent un lien distinct de Cdx2 pendant le développement et l'homéostasie." Nat Commun2025 16(1) : 929 Désolé, je ne peux pas accéder à des contenus externes.